בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הגישה הטכנית לבידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני רקמת שומן לבן תוך בטני (WAT) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או הפרדת חרוזים אימונומגנטית.
Abstract
החלק הסטרומלי-וסקולרי (SVF) של רקמת השומן הלבנה (WAT) הוא הטרוגני להפליא ומורכב מסוגי תאים רבים התורמים פונקציונלית להתרחבות ועיצוב מחדש של WAT בבגרות. מחסום עצום לחקר ההשלכות של הטרוגניות תאית זו הוא חוסר היכולת לבודד בקלות תת-אוכלוסיות תאים מובחנות מבחינה תפקודית מ- WAT SVF עבור ניתוחי in vitro ו- in vivo. טכנולוגיית ריצוף חד-תאי זיהתה לאחרונה תת-אוכלוסיות של תאים פיברו-דלקתיים ואדיפוגניים PDGFRβ+ פריו-וסקולריים מובחנים מבחינה תפקודית במחסני WAT תוך-בטניים של עכברים בוגרים. אבות פיברו-דלקתיים (המכונים “FIPs”) הם תאים מייצרי קולגן לא אדיפוגניים שיכולים להפעיל פנוטיפ פרו-דלקתי. PDGFRβ+ תאים מבשרי אדיפוציט (APCs) הם אדיפוגניים מאוד הן במבחנה והן in vivo לאחר השתלת תאים. במאמר זה אנו מתארים שיטות רבות לבידוד תת-אוכלוסיות אלה של תאי סטרומה ממחסני WAT תוך-בטניים של מורין. ניתן לבודד FIPs ו-APCs על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) או על ידי ניצול טכנולוגיית חרוזים אימונומגנטיים מבוססת נוגדנים ביוטינילציה. תאים מבודדים יכולים לשמש לניתוח מולקולרי ופונקציונלי. חקר התכונות התפקודיות של תת-אוכלוסיית תאי סטרומה בבידוד ירחיב את הידע הנוכחי שלנו על עיצוב מחדש של רקמת שומן בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים ברמה התאית.
Introduction
רקמת השומן הלבן (WAT) מייצגת את האתר העיקרי לאגירת אנרגיה ביונקים. בתוך רקמה זו, אדיפוציטים, או “תאי שומן”, מאחסנים קלוריות עודפות בצורה של טריגליצרידים, ארוזים לתוך טיפות שומנים חד עיניות גדולות. יתר על כן, אדיפוציטים מפרישים מספר רב של גורמים המווסתים היבטים שונים של הומאוסטזיס אנרגיה 1,2,3. אדיפוציטים מהווים את עיקר נפח WAT; עם זאת, אדיפוציטים מייצגים רק פחות מ-50% מכלל התאים הנמצאים ב-WAT 4,5. התא הלא-אדיפוציטי של WAT, או מקטע סטרומה-כלי דם (SVF), הוא הטרוגני למדי ומכיל תאי אנדותל וסקולריים, תאי חיסון שוכנים ברקמות, פיברובלסטים ואוכלוסיות תאים מבשרי אדיפוציט (APC).
WAT יוצאת דופן ביכולתה יוצאת הדופן להתרחב בגודלה ככל שהביקוש לאגירת אנרגיה גדל. שמירה על פלסטיות רקמה זו חיונית מכיוון שאחסון נאות של שומנים ב- WAT מגן מפני שקיעת שומנים חוץ רחמית מזיקה לרקמות שאינן שומן6. האופן שבו מחסני WAT בודדים עוברים הרחבה זו בתגובה לעודף קלורי הוא גורם קריטי לרגישות לאינסולין במצב של השמנת יתר7. הרחבת WAT פתולוגית, שנצפתה אצל אנשים שמנים עם תסמונת מטבולית, מאופיינת בהרחבה מועדפת של מחסני WAT ויסצרליים על חשבון רקמת שומן תת עורית חיובית מטבולית. יתר על כן, עמידות לאינסולין בהשמנת יתר קשורה לשיפוץ פתולוגי של WAT. זה מאופיין בצמיחה היפרטרופית של אדיפוציטים קיימים (גידול בגודל), אנגיוגנזה לא מספקת, דלקת מטבולית כרונית, הצטברות של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים (פיברוזיס), והיפוקסיה רקמות 8,9. פנוטיפים אלה של WAT של השמנת יתר קשורים בסטאטוזיס בכבד ותנגודת לאינסולין, בדומה למה שנצפה במצב של lipodystrophy (היעדר WAT תפקודי). לעומת זאת, התרחבות WAT בריאה נצפתה באוכלוסיית השמנים הבריאים מבחינה מטבולית ומאופיינת בהרחבה מועדפת של WAT תת עורי מגן והרחבת מחסן באמצעות היפרפלזיה אדיפוציט10. הגיוס של אדיפוציטים חדשים מתווך על ידי התמיינות דה נובו אדיפוציט מתאים מבשרי אדיפוציט (APCs) (המכונים, “אדיפוגנזה”). היפרפלזיה אדיפוציט עולה בקנה אחד עם דרגות נמוכות יחסית של פיברוזיס WAT ודלקת מטבולית 6,11. מספר רב של סוגי תאים בתוך המיקרו-סביבה של WAT משפיעים ישירות על הבריאות ויכולת ההתרחבות של WAT בהשמנת יתר12. לפיכך, הגדרת הפונקציה של סוגי התאים השונים הקיימים ב- WAT נותרה בעדיפות גבוהה עבור השדה.
במהלך העשור האחרון, מספר אסטרטגיות הופעלו כדי להגדיר ולבודד נגמ”שים מקוריים מאדם ועכבר WAT SVF13. אסטרטגיות כאלה מבודדות APCs בהתבסס על ביטוי פני התא של סמני גזע / תאי אב מזנכימליים נפוצים באמצעות טכניקות הפרדת תאים מבוססות נוגדנים. גישות אלה כוללות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS), שימוש בנוגדנים המסומנים בתווית פלואורופור, או הפרדת חרוזים אימונומגנטית (כלומר, נוגדנים מהונדסים כימית). חלבוני פני השטח של התא המיועדים לבידוד APCs כוללים PDGFRα, PDGFRβ, CD34 ו-SCA-1. גישות אלה סייעו להעשיר את הנגמ”שים; עם זאת, אוכלוסיות תאים המבודדות על סמך סמנים אלה הן הטרוגניות למדי. מחקרי ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) שנערכו לאחרונה הדגישו את ההטרוגניות המולקולרית והתפקודית של תאי סטרומה בתוך החלק הסטרומה-כלי הדם המבודד (SVF) של מורין WAT 14,15,16,17. מה-scRNA-seq והניתוחים הפונקציונליים שלנו, זיהינו ואפיינו תת-אוכלוסיות של תאים פריווסקולרים מווסתים חיסוניים ואדיפוגניים PDGFRβ+ בתא סטרומה של WAT תוך-בטני בעכברים בוגרים15. מבשרי פיברו-דלקתיים, או FIPs, מייצגים תת-אוכלוסייה בולטת של תאי PDGFRβ+ וניתן לבודד אותם על בסיס ביטוי LY6C (תאי LY6C+ PDGFRβ+)15. FIPs חסרי יכולת אדיפוגנית, מפעילים תגובה פרו-דלקתית חזקה לגירויים שונים, מייצרים קולגן ומפרישים גורמים אנטי-אדיפוגניים15. הפעילות הפרו-דלקתית והפיברוגנית של תאים אלה עולה בהקשר להשמנת יתר בעכברים, מה שמסבך תאים אלה כרגולטורים של עיצוב מחדש של VAT. תת-האוכלוסייה LY6C- CD9- PDGFRβ+ מייצגת תאים מבשרי אדיפוציט (APC). נגמ”שים אלה מועשרים בביטוי של Pparg וגנים פרו-אדיפוגניים אחרים, ומתמיינים בקלות לאדיפוציטים בוגרים במבחנה ו-in vivo15. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד אוכלוסיות תאים מובחנות אלה ממחסני WAT תוך בטניים של עכברים בוגרים באמצעות FACS, והפרדת חרוזים אימונומגנטית עם נוגדנים ביוטינילציה. פרוטוקול זה יכול לשמש לבידוד תת-אוכלוסיות אב שומניות מובחנות מבחינה תפקודית ממחסני WAT תוך-בטניים מרובים של עכברים בוגרים זכרים ונקבות15. חקר אוכלוסיות תאים מובחנות מבחינה תפקודית אלה בבידוד עשוי לתרום רבות להבנתנו הנוכחית של המנגנונים המולקולריים המווסתים אדיפוגנזה ועיצוב מחדש של רקמת שומן תוך בטנית בבריאות ובחולי.
הפרוטוקול שלהלן מפרט את בידודם של אבות השומן מ- MURINE epididymal WAT; עם זאת, ניתן להשתמש באותו הליך כדי לבודד תאים מתאימים ממחסני WAT מזנטריים ורטרופריטוניאליים של עכברים זכרים ונקבותכאחד 15. פרוטוקול מפורט כיצד לזהות ולבודד מחסנים אלה בעכברים ניתן למצוא ב- Bagchi et al.18. פרוטוקול זה הותאם לשימוש בעכברים בגילאי 6-8 שבועות. התדירות ויכולת ההתמיינות של נגמ”שים עשויים לרדת בקשר להזדקנות.
Protocol
Representative Results
Discussion
זן C57BL/6 של עכברים הוא זן העכבר הנפוץ ביותר במחקרים על השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה. עכברי C57BL/6 עולים במהירות במשקל כאשר הם עוברים לדיאטה עתירת שומן (HFD) ומפתחים כמה מהמאפיינים הבולטים של תסמונת מטבולית הקשורים להשמנת יתר (למשל, עמידות לאינסולין והיפרליפידמיה). יש לציין כי התרחבות WAT המתרחשת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה לליסה הנסן וקירסטן וסטרגארד על הסיוע הטכני המצוין, ולפ’ שרר, נ’ ג’ופין וק’ קרו על קריאה ביקורתית של כתב היד. המחברים מודים ל-UTSW Flow Cytometry Core על הדרכה מעולה וסיוע בפיתוח הפרוטוקולים המתוארים כאן. R.K.G. נתמך על ידי NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 ו- NIDDK R01 DK119163. J.P. ממומן על ידי פרס טרום דוקטורט מקרן החדשנות דנמרק.
Materials
| Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation | |||
| 40 and 100 µm cell strainers | Fisher Scientific | 352340/352360 | |
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 21040CV | |
| 5ml polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352053 | |
| Digestion Buffer (for 10mL) | |||
| 10 ml HBSS | Sigma | H8264 | |
| 10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.) | Roche | 11088882001 | |
| 0.15 g BSA (1.5 % final cc.) | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs | |||
| 5X MojoSort Buffer (MS buffer) | BioLegend | 480017 | |
| 5 ml MojoSort Magnet (MS magnet) | BioLegend | 480019 | |
| 100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480015 | |
| Purity Check and FACS | |||
| 10X Red Blood Cell Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Fc block (Mouse CD16/CD32) | eBioscience | 553141 | |
| Antibodies | |||
| Biotin CD45 | BioLegend | 103103 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| Biotin CD31 | BioLegend | 102503 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MEC13.3 |
| Biotin CD9 | BioLegend | 124803 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Biotin LY6C | BioLegend | 128003 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD31-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 102419 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 390 |
| CD45-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 103131 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| CD140b PDGFRβ-PE | BioLegend | 136006 | Concentration: Dilution 1:50 Species: Mouse Clone: APB5 |
| LY6C-APC | BioLegend | 128016 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD9-FITC | BioLegend | 124808 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Cell Culture and Differentiation | |||
| Gonadal APC Culture media (for 500mL) | |||
| 288 mL DMEM with 1 g/L glucose | Corning | 10-014-CV | |
| 192 mL MCDB201 | Sigma | M6770 | |
| 10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024 | Sigma | 12303C | |
| 5 mL 100% ITS premix | BD Bioscience | 354352 | |
| 5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| 50 µL 100 g/ml FGF-basic | R&D systems | 3139-FB-025/CF | |
| 5 mL Pen/Strep | Corning | 30-001-CI | |
| 500 µL Gentamycin | Gibco | 15750-060 | |
| **NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested. |
References
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
- Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
- Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
- Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
- Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
- Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324 (2009).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
- Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30 (2016).
- Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
- Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
- Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861 (2018).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
- Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890 (2018).
- Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
- Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).
