本协议描述了使用西斯铂作为肾毒剂在成年斑马鱼中诱导急性肾损伤 (AKI) 的程序。我们详细介绍了评估该技术和两种技术的可重复性,分别分析肾脏组织、流动细胞学和TUNEL中的炎症和细胞死亡。
西斯铂通常用作化疗。虽然它对癌症治疗的个人有积极的影响,但西斯铂由于分子量低,很容易在肾脏中积累。这种积累导致管状细胞死亡,并可诱发急性肾损伤(AKI)的发展,其特点是肾功能迅速减少、组织损伤和免疫细胞渗透。如果以特定剂量施用西斯铂,则作为动物模型中的AKI诱导剂可以是一个有用的工具。斑马鱼作为研究肾功能、肾脏再生和损伤的有趣模型出现,因为肾脏结构保存了与哺乳动物的功能相似性。注射西斯铂的成年斑马鱼在注射后24小时(hpi)后存活率下降,肾细胞死亡,炎症标记增加。在这个模型中,免疫细胞渗透和细胞死亡可以通过流动细胞测量和TUNEL检测来评估。本协议描述了通过肾内静脉注射诱导成年斑马鱼中的AKI的程序,并随后演示了如何收集肾脏组织用于流动细胞处理和细胞死亡TUNEL检测。这些技术将有助于了解西斯铂作为肾毒剂的影响,并将有助于成人斑马鱼的AKI模型的扩展。该模型还可用于研究肾脏再生,寻找治疗或预防肾脏损伤的化合物,并研究AKI中的炎症。此外,本协议中使用的方法将改善组织损伤和炎症的特征,这是肾脏相关合并症的治疗目标。
肾脏负责维持平衡的几个重要生理功能,如血液过滤,去除多余的残留物,以及调节离子浓度1。肾脏组织的损伤可导致一种称为急性肾损伤(AKI)的异质性疾病,临床上被描述为由管状上皮细胞破坏和死亡、内皮细胞损伤和白细胞渗透2、3引起的肾功能迅速下降。AKI是一种疾病,预计在8-16%的住院4,与高死亡率范围从20至50%的重症监护病房(ICU)5。这种疾病与住院时间增加和大量使用财政资源有关。病因包括脱水、休克、感染、败血症、心血管疾病和肾毒药物6。肾毒性被定义为药物诱发的肾损伤,引起AKI、管状病变和球状动脉病7的效果。肾毒性影响三分之二的ICU患者,因为ICU中约20%的药物被认为是肾毒性8,9,这包括非类固醇抗炎药物(NSAIDs),抗生素,如万康霉素和氨基糖苷,化疗剂,如甲氨蝶酯和西斯铂7。Cisplatin是最有效和最常见的化疗药物之一,用于治疗实体肿瘤,如头部和颈部,睾丸,卵巢和膀胱10。在肾脏中,cisplatin通过有机血缘运输器2(OCT-2)在近部错综复杂的管(PCT)内化,高浓度与DNA结合触发细胞死亡途径7,10,11,12。这种药物在肾脏的积累有助于肾毒性与死亡和炎症13。这种有害的副作用极大地影响三分之一接受西斯铂治疗的癌症患者的生命和预后,因此迫切需要研究新的疗法,可以降低肾毒性,而不会失去对癌细胞的杀灭作用10。
由于这种肾毒性作用,西斯铂在实验动物模型中通常用作AKI的电感器,如前所述。在啮齿动物中,第一个由西斯铂诱导的AKI模型于1971年14年被报道,但目前,许多不同的协议已经出现使用剂量依赖和累积效应的西斯铂15。因此,根据申请的剂量和数量,肾损伤的严重程度可诱发16、17、18、19、20、21。最常见的方法包括注射一剂西斯铂,然后在接下来的几天内安乐死。在这个经典的协议中,单个高肾毒剂量的西斯铂(小鼠10-13毫克/千克和/或3-8毫克/千克大鼠)诱发严重的组织学变化,如管状流明内的刷边界和细胞碎片损失,在西铂注射几天后。病理变化的严重程度取决于剂量,在西斯铂注射16、17后7天观察到再生迹象。
虽然啮齿动物模型已经建立,但我们决定利用另一种脊椎动物的特性,将研究重点放在斑马鱼(Danio rerio)上。这种鱼由于体积小、外受精多、繁殖率高、发育迅速、胚胎和幼虫透明度高、维护成本低、解剖与哺乳动物相似(有些例外)、组织再生能力高、社会行为等原因,70%的基因与人类相似,84%与人类疾病相关的基因22。斯特里辛格等人于23日、24日、25日开始对斑马鱼进行研究,证实了利用这种模型生物体进行脊椎动物发育基因分析的可行性。在肾脏研究中,斑马鱼不仅出现在发育研究中,而且作为寻找与肾脏疾病有关的新基因的基因工具。此外,没有疤痕形成的再生能力,以及通过它们的生命产生肾上腺素的能力,称为肾生成,使斑马鱼成为再生研究的关键动物模型27,28。此外,不同肾脏疾病的实验模型,包括急性和慢性肾损伤,证明了这种实验生物体26,29的多功能性。与哺乳动物一样,斑马鱼的肾祖源来自中间中皮。这种肾祖辈产生容易发炎,以后会发展成梅松磷,这将保持作为一个成熟的器官,直到成年29,30。
成年斑马鱼肾位于身体的后壁上,在游泳膀胱和骨干29之间。从腹腔看,斑马鱼可以分为三个区域(图1A):头(H)、树干(Tr)和尾部(Ta)29。与哺乳动物一样,斑马鱼有肾作为肾脏的功能单位,分为管状部分(图1A):肾骨(RC)、近侧错综复杂的管状管(PCT)、近直管(PST)、早(DE)、晚分体(DL)和收集管(CD)29。斑马鱼与人类肾上腺(图1B)有遗传保护和结构相似性,但缺乏一些构象,如中间管状物,也被称为母鸡(LH)29,31的循环。淡水鱼,如斑马鱼,通常被一个非常低的渗透性介质包围,因此,它们往往是超渗透的,并依赖于刺,皮肤在早期阶段,和肾脏来调节渗透和水排泄32。从主动脉的血液过滤开始约48小时后施肥(hpf)33,34。斑马鱼的肾脏不仅是一种代谢废物排泄器官,而且从受精后4天(dpf)到成年,它相当于哺乳动物35的骨髓。在发育过程中,造血干细胞(HSCs)将播种肾脏,自我改造,并产生骨髓、红细胞和淋巴细胞系,维持转录因子、信号分子和高度保存的遗传程序与哺乳动物36,37。研究表明,人类免疫系统中大多数红斑、血栓、骨髓和淋巴细胞都存在于斑马鱼37、38中。这种动物的独特特征和人类肾脏的保存特征使这种模型有机体在肾功能、损伤和再生研究方面具有优势。
虽然斑马鱼的肾脏研究得当,一些型号的AKI已经可用于幼虫和成年斑马鱼28,但在制定本协议时,没有证据表明成年斑马鱼中有化学诱发的非抗生素AKI模型。除此之外,我们的实验室还专注于测试益生菌和微生物衍生化合物,以研究再生和肾脏损伤,因此我们集中力量在成年鱼类中创建一个新的西斯铂诱导的AKI模型。本手稿中的视频文章演示了AKI感应新模型的程序,该模式使用每克动物(120微克/克)注射120微克西斯铂(图2A)。这种剂量最初是基于研究AKI诱导的血清素在穆林模型,去约10毫克/千克(相当于10微克/克)14,15,16,17,然而,这种剂量不足以诱导肾脏损伤相关的肾毒性(数据未显示)。因此,我们增加了剂量,在这项研究中使用的 (图2B) 。我们的工作揭示了西斯铂在注射后存活率的剂量依赖效应,诱导肾脏组织损伤24hpi,如管状结构丧失、炎症渗透增加和细胞死亡率高所示。在这里,我们描述了两种技术来分析西斯铂诱导AKI的发展:流动细胞测量,分析细胞渗透,和TUNETL,以测量细胞死亡。流动细胞测量是测量细胞的物理(大小和粒度)和化学(荧光化合物)特性的技术。在细胞计内,细胞悬架通过一个护套流体,将细胞组织成一条线,允许它们一次通过一个细胞的激光束(图3A)。光束前的探测器将测量与细胞大小相关的前散射(FSC),侧面的探测器将测量与细胞粒度相关的侧散射(SSC)。其他探测器将测量粒子、荧光蛋白或抗体标记细胞39、40的荧光。由于目前斑马鱼的商业抗体很少,使用动物记者和荧光生物标志物可以改进这一分析,并识别不同的细胞种群41,42,43。此协议中使用的另一个工具是终端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) dUTP 尼克端标签 (TUNEL) 检测。TUNEL检测是一种晚期凋亡检测方法,依靠TdT识别碎片DNA的能力,并将其贴上带有荧光标记的脱氧核苷酸标签,然后可以通过显微镜44(图3B)进行可视化和量化。考虑到AKI最引人注目的特征之一是管状肾细胞3中凋亡的诱导,这种技术是非常有利的,因为它可以通过流动细胞学和/或显微镜进行分析。
本文中介绍的方法允许观察AKI状态,并提供一个新的急性模型来研究AKI疾病,可用于研究与西斯铂相关的AKI中的新治疗目标。
肾脏疾病的流行率在全世界持续上升,成为影响数百万人的全球公共卫生问题。找到治疗肾伤者的方法至关重要,也最重要的是了解他们病因和进展。一些研究一直在使用动物模型来了解肾脏损伤。斑马鱼肾(图1)由于其自我再生能力和遗传相似性,多年来一直在发育生物学和损伤研究中研究。在这里,我们介绍了一个新的AKI模型在成年斑马鱼使用西斯铂作为肾毒剂的特性,详细说明了完成快速和急性反应的步骤,损害可见,只要24hpi(图2)。此外,在这里我们解释两种技术,这将有助于评估后,西斯铂注射,流动细胞测量和TUNEL(图3)的组织损伤。
目前成年斑马鱼的AKI模型包括注射根酰胺素,在肾上腺素和管状物破坏中引起广泛损害,肾生成事件从第5天开始,在注射后21天完成再生65天。另一方面, 败血症相关急性肾损伤(S-AKI)模型是由爱德华西拉塔达感染建立的,因为显著增加了AKI标记物的表达,如胰岛素样生长因子结合蛋白-7(IGFBP7),金属蛋白酶2(TIMP-2)的组织抑制剂,以及幼虫和成年斑马鱼66中的肾损伤分子-1(KIM-1)的表达。斑马鱼是众所周知的高通量动物寻找治疗剂,这包括使用益生菌和微生物源代谢物研究肾功能和再生67。然而,现有的模型可能直接影响到这些治疗的结果。因此,我们建立了一种不同的方法来诱导成年斑马鱼的AKI(图4),使用西斯铂作为已知的肾毒剂,不会直接已知对鱼微生物群的影响,就像根塔霉素模型是抗生素,或感染E.tarda,作为败血症模型。然而,在我们开发我们的西斯铂协议的同时,另一组人也探索了成年斑马鱼中西铂的肾毒性作用,将剂量简化为每只动物10-20-30微克68。虽然它们在生存中也显示出西斯铂剂量依赖效应,但我们建议谨慎使用单量的西斯铂为所有鱼类,因为斑马鱼从同龄可以有很大的不同大小和重量,这可能会诱导结果的变化69,70。我们认为重要的是调整剂量到相应的重量的动物,如在小鼠和这项研究。
在我们对成年斑马鱼的实验中,西斯铂显示出剂量反应效果。这是通过监测西斯铂注射后动物的存活率(图5)来实现的。我们用生存作为估计西斯铂剂量强度的一种方式,而不是作为肾毒性的测量方法,因为在监测期间看不到其他物理迹象。这可以与啮齿动物相媲美,其中肾损伤的严重程度可以通过西斯铂注射15的剂量和频率来调节,达到致命剂量,浓度较高的西斯铂71。在接下来的几天里,在西斯普拉廷72的幼虫模型中也出现了死亡。由于我们的目标是在几天内诱发急性损伤,我们选择了120微克/克剂量的西斯铂,以观察注射后24小时肾脏损伤,但是,这可以根据研究的目标进行调整。
在人类中,AKI通过降低球状过滤率(GFR)、血清肌酸升高和血尿素氮3进行临床诊断。在斑马鱼中,AKI模型的剧目包括一些遗传条件模型73、74和一些与药物相关的模型65、72,但由于一些AKI功能参数由于技术困难(如采血)而无法测量斑马鱼,大多数研究采用形态学和视觉技术来观察AKI1、75等特征,如我们的研究。
在啮齿动物中,cisplatin进入近端和分离管中的上皮细胞,细胞内进行代谢活化,对细胞细胞细胞产生高度反应作用,并诱导细胞结构的变化。这些变化可以诱发凋亡和自噬,甚至坏死,在非常高的剂量。为了应对这种损害,许多细胞因子被释放和白细胞被招募导致炎症和影响器官功能15。这突出了评估在受伤的肾脏中可以发现哪些类型的细胞的重要性,作为居民或渗透的免疫细胞。在这里,我们展示了如何评估流细胞测量,使用转基因免疫记者线可用现在(表1)。注射后24小时,西斯铂增加了肾脏中嗜中性粒细胞(mpo:GFP 正细胞)的百分比(图6)。就斑马鱼而言,肾脏是产生不同血细胞类型的HSC的利基。尽管如此,许多颗粒和巨噬细胞通常在血液中循环。在我们的例子中,我们使用了 mpo:GFP 转基因线,在中微子52的骨髓酶的促进下表达GFP。 mpo:GFP 转基因线的原始研究表明,在中性粒细胞成熟76 的不同状态下,骨髓酶的表达,但我们的门策略侧重于由来自血液52的成熟细胞组成的粒细胞分,这样我们的分析包括渗透细胞,而不是常驻细胞。在隔离所需细胞群时,必须考虑这一点。
如上所述,凋亡是与西斯铂相关的AKI的最经典标记。在这里,我们演示了一个简单的协议,通过TUNYL检测使死细胞本地化。西斯铂注射增加了凋亡细胞的数量24hpi(图7)。这可以通过直接计算组织中的死细胞来轻松量化。然而,为了识别细胞特异性死亡,使用抗体对抗所需的细胞(如 管状细胞),或使用转基因报告线可以与此技术一起使用。与AKI的根塔米辛诱导模型相比,cisplatin似乎是一个更严重的模型,因为在注射65后的第三天,根他汀凋亡率更高。
尽管有各种副作用,cisplatin仍然广泛用于癌症治疗,因为它对各种类型的癌症,包括癌变,生殖细胞肿瘤,淋巴瘤和肉瘤77有效。肾毒性发生在三分之一的患者在治疗与西斯铂10,因此寻找策略,可以减少这种影响,增加再保护是势在必行的。我们相信,本手稿中介绍的方法和技术将有助于阐明肾损伤的机制,并找到治疗目标,这些靶点对于提高肾并发症患者的生活质量至关重要,主要是与使用西斯铂相关的治疗目标。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了安帕罗基金会的支持 – 圣保罗埃斯奎萨 – FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5;2018/20722-4),国家德森沃尔维门托·科蒂菲科·特克诺莱吉科(CNPq)和库德纳奥·德·阿佩菲奥门托·德佩索阿尔·德尼维尔高级(CAPES),财务代码001。我们感谢在圣保罗大学生物科学研究所的玛丽亚·丽塔·多斯桑托斯·帕索斯-布埃诺实验室和遗传学和进化生物学系斑马鱼设施的合作者。我们衷心感谢克里斯蒂亚娜·纳法·德苏扎·布雷达和特蕾莎·拉克尔·德奥利维拉·拉马略对手稿的意见和建议。我们非常感谢生物医学研究所多媒体团队的马西奥·维拉尔·马丁斯录制、编辑和制作这段视频。
1x PBS | Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water | ||
31 G 1.0 cc insulin syringe | BD Plastipak | 990256 | Needle: BD Precision Glide 300110 |
3.5 L Fish tank | Tecniplast | Part of the aquactic system | |
6 well plate | Corning | 351146 | |
10 mM Tris/HCl | Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000) | ||
50 ml Falcon tube | Corning | 352070 | |
2-3% Agarose | Invitrogen | 16500-500 | Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve. |
2% FBS | Gibco | 12657-09 | Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS |
4% Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C |
50% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
70% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
90% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
100% Ethanol | Synth | 00A1115.01.BJ | |
100% Xylene | Synth | 00X1001.11.BJ | |
Cell strainer 40 µm | Corning | 431750 | |
Cisplatin | Blau Farmacêutica | 16020227 | C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature. |
Cork board sheet | Obtained from local stationary store | ||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Stock solution 20 mg/ml dissolved in water |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Flow cytometry tubes | Corning | 352052 | |
Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
Histology cassette | Ciencor | 2921 | |
Immuno stain chamber | Ciencor | EP-51-05022 | |
Incubator | NAPCO | 5400 | Set to 37 °C |
Insect pins | Papillon | Model micro15x20 | |
In Situ Cell Death Detection Kit | Roche Diagnostics | 12156792910 | |
Metal mold | Leica Biosystems | 3803081 | |
Micropipette 200-1000 µL | Eppendorf | Use 1 mL tips | |
MS-222 (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040-25G | |
NaCl 0.9% | Synth | C1060.01.AG | Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water |
Nail polish | Prefer transparent | ||
Neubauer chamber | Precicolor HGB | ||
Pasteur plastic pipet | United Scientific Supplies | P31201 | |
Paraplast | Sigma-Aldrich | P3558 | |
Petri dish | J.ProLab | 0307-1/6 | 60 and 100 mm |
Plastic spoon | Obtained from local store | ||
Proteinase K | New England BioLabs | P8102 | Diluite from stock 20 mg/ml |
Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Scalpel blade | Solidor | ||
Sponge | Obtained from local store | ||
Trypan Blue | Cromoline | 10621/07 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Cytometer | BD Biosciences | FACSCanto II | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Fluorescence Microscope | Zeiss | AxioVert.A1 | |
Microtome | Leica | Jung Supercut | |
Scale | Ohaus Corporation | AR2140 |