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의학

Modelo de lesão renal aguda induzida por cisplatina em zebrafish adulto

Published: May 15, 2021
doi:
10.3791/61575
, , , , , ,
1Department of Immunology,University of São Paulo, 2Department of Medicine, Nephrology Division,Federal University of São Paulo

Summary

Este protocolo descreve os procedimentos para induzir lesão renal aguda (AKI) em zebrafish adulto usando cisplatina como um agente nefrotóxico. Detalhamos as etapas para avaliar a reprodutibilidade da técnica e duas técnicas para analisar inflamação e morte celular no tecido renal, citometria de fluxo e TUNEL, respectivamente.

Abstract

Cisplatina é comumente usada como quimioterapia. Embora tenha efeitos positivos em indivíduos tratados com câncer, a cisplatina pode facilmente se acumular no rim devido ao seu baixo peso molecular. Esse acúmulo causa a morte de células tubulares e pode induzir o desenvolvimento de Lesão Renal Aguda (AKI), que é caracterizada por uma rápida diminuição da função renal, danos teciduais e infiltração de células imunes. Se administrada em doses específicas cisplatina pode ser uma ferramenta útil como um indutor AKI em modelos animais. O zebrafish tem aparecido como um modelo interessante para estudar a função renal, a regeneração renal e a lesão, já que as estruturas renais conservam semelhanças funcionais com os mamíferos. Zebrafish adulto injetado com cisplatina mostra diminuição da sobrevida, morte das células renais e aumento dos marcadores de inflamação após 24h após a injeção (hpi). Neste modelo, a infiltração de células imunes e a morte celular podem ser avaliadas por citometria de fluxo e ensaio TUNEL. Este protocolo descreve os procedimentos para induzir AKI em zebrafish adulto por injeção intraperitoneal de cisplatina e, posteriormente, demonstra como coletar o tecido renal para processamento de citometria de fluxo e ensaio tunel de morte celular. Essas técnicas serão úteis para entender os efeitos da cisplatina como agente nefrotóxico e contribuirão para a expansão dos modelos AKI em zebrafish adultos. Este modelo também pode ser usado para estudar a regeneração renal, na busca de compostos que tratem ou previnem danos nos rins e para estudar inflamação em AKI. Além disso, os métodos utilizados neste protocolo melhorarão a caracterização de danos teciduais e inflamação, que são alvos terapêuticos em comorbidades associadas aos rins.

Introduction

Os rins são responsáveis por diversas funções fisiológicas importantes que mantêm a homeostase, como filtração de sangue, remoção de resíduos em excesso e regulação das concentrações de íons1. Danos no tecido renal podem levar a uma condição heterogênea chamada Lesão Renal Aguda (AKI), que clinicamente é descrita como uma rápida diminuição da função renal causada pela destruição e morte de células epiteliais tubulares, lesão celular endotelial e infiltração leucócito 2,3. AKI é uma condição prevista para acontecer em 8-16% das internaçõeshospitalares 4, com uma alta taxa de mortalidade que varia de 20 a 50% na unidade de terapia intensiva (UTI)5. Essa doença está associada ao aumento da internação hospitalar e ao uso considerável dos recursos financeiros5. Os fatores etiológicos incluem desidratação, choque, infecções, sepse, doenças cardiovasculares e medicamentos nefrotóxicos6. A nefrotoxicidade é definida como uma lesão renal induzida por drogas, causando efeitos como AKI, tubulopatias e glomerulopatias7. A nefrotoxicidade afeta dois terços dos pacientes da UTI, já que aproximadamente 20% dos medicamentos prescritos na UTI são considerados nefrotóxicos8,9, isso inclui anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs), antibióticos como vancomicina e aminoglycosides, e agentes quimioterápicos como metotrexato e cisplatina7. A cisplatina é uma das drogas de quimioterapia mais potentes e comuns, utilizada no tratamento de tumores sólidos, como cabeça e pescoço, testicular, ovário e bexiga10. No rim, a cisplatina é internalizada no tubo proximal convolutado (PCT) através do transportador cônico orgânico 2 (OUT-2) e em altas concentrações se liga ao DNA desencadeando vias de morte celular7,10,11,12. O acúmulo dessa droga no rim contribui para a nefrotoxicidade com morte e inflamação13. Esse efeito colateral prejudicial afeta enormemente a vida e o prognóstico de um terço dos pacientes com câncer submetidos ao tratamento de cisplatina, por isso é imperativo a pesquisa de novas terapias que podem diminuir a nefrotoxicidade sem perder o efeito de morte nas célulascancerosas 10.

Devido a este efeito nefrotóxico, a cisplatina é comumente usada como um indutor de AKI em modelos animais experimentais, como descrito para a frente. Nos roedores, o primeiro modelo AKI induzido pela cisplatina foi relatado em 197114, mas atualmente, muitos protocolos diferentes surgiram utilizando os efeitos dependentes de dose e cumulativos da cisplatina15. Assim, dependendo da dosagem e do número de aplicações, diferentes graus de gravidade da lesão renal podem ser induzidos16,17,18,19,20,21. O método mais frequente consiste em uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma dose de cisplatina seguida de eutanásia nos dias seguintes. Neste protocolo clássico, uma única dose nefrotoxica alta de cisplatina (10-13 mg/kg em camundongos e/ou 3-8 mg/kg em ratos) induz severas alterações histológicas, como perda de borda de escova e detritos celulares dentro do lúmen tubular, poucos dias após a injeção de cisplatina. A gravidade das alterações histológicas é dependente de dose, e os sinais de regeneração são observados 7 dias após a injeção de cisplatina16,17.

Embora os modelos de roedores sejam bem estabelecidos, decidimos aproveitar as características de outro vertebrado, focando nossos estudos sobre o zebrafish (Danio rerio). Este peixe tem sido amplamente utilizado para modelar doenças humanas, devido ao seu pequeno tamanho, fertilização externa, altas taxas de reprodução, desenvolvimento rápido, transparência dos embriões e larvas, baixo custo de manutenção, anatomia semelhante aos mamíferos (com algumas exceções), alta capacidade de regeneração tecidual, comportamento social, 70% de semelhança genética com humanos e 84% com genes associados a doenças humanas22. Streisinger et al.23,24,25 iniciaram os estudos com zebrafish que confirmaram a praticabilidade de utilizar este organismo modelo para a análise genética do desenvolvimento de vertebrados. Na pesquisa renal, o zebrafish surgiu não apenas em estudos de desenvolvimento, mas também como ferramenta genética na busca de novos genes ligados às condições renais26. Além disso, a capacidade de regeneração sem formação de cicatrizes e a capacidade de gerar nefrões ao longo de sua vida, chamada neonephrogenesis, fazem do zebrafish um modelo animal chave para a pesquisa de regeneração27,28. Além disso, a disponibilidade de modelos experimentais para diferentes doenças renais, incluindo lesão renal aguda e crônica, demonstra a versatilidade deste organismo experimental26,29. Como nos mamíferos, os progenitores renais dos zebrafish são derivados do mesoderm intermediário. Tais progenitores renais geram os progenros propensos que mais tarde se desenvolverão aos mesonephros, que serão mantidos como órgão maduro até a idade adulta29,30.

O rim de zebrafish adulto está localizado na parede dorsal do corpo, entre a bexiga de natação e a espinha dorsal29. A partir de uma visão ventral, o zebrafish pode ser segmentado em três regiões (Figura 1A): cabeça (H), tronco (Tr) e cauda (Ta)29. Assim como os mamíferos, o peixe-zebra possui os nefrões como unidades funcionais do rim, que são divididos em segmentos de túbulos(Figura 1A):corpúsculo renal (RC), túbulo convolucido proximal (PCT), túbulo proximal reto (PST), distal (DE), distal tardio (DL) e ducto coletor (CD)29. O zebrafish compartilha conservação genética e semelhanças estruturais com nefrões humanos (Figura 1B),mas carece de algumas conformações, como o túbulo intermediário, também conhecido como o laço de Henle (LH)29,31. Peixes de água doce como o zebrafish são normalmente cercados por um meio com osmolaridade muito baixa, por causa disso, eles tendem a ser hiperosmóticos e dependem das brânquias, da pele em estágios iniciais, e do rim para regular a osmolaridade e excreção de água32. A filtragem de sangue da aorta dorsal pelos pronephros começa em torno de 48h pós-fertilização (hpf)33,34. O rim do zebrafish não é apenas um órgão de excreção de resíduos metabólicos, mas também funciona como um órgão hematopoiético de 4 dias pós-fertilização (dpf) até a idade adulta e é equivalente à medula óssea em mamíferos35. Durante o desenvolvimento, as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) semearão o rim, auto-renovarão e gerarão linhagens de células mieloides, eritróidas e linfoides, mantendo fatores de transcrição, moléculas de sinalização e programas genéticos altamente conservados com mamíferos36,37. Estudos revelaram que a maioria das células eritróidas, trombocíticas, mielóides e linfoides do sistema imunológico humano estão presentes no zebrafish37,38. As características únicas deste animal e as características conservadas com o rim humano tornaram este organismo modelo vantajoso na pesquisa da função renal, lesão e regeneração.

Embora o rim do zebrafish seja bem estudado e alguns modelos de AKI já estejam disponíveis em larvas e zebrafishadultos 28, no momento da criação deste protocolo não havia evidência de um modelo AKI não-antibiótico quimicamente induzido em zebrafish adulto. Além disso, nosso laboratório se concentra em testar bactérias probióticas e compostos derivados de microbiota para estudar regeneração e danos renais, assim concentramos nossos esforços na criação de um novo modelo AKI induzido por cisplatina em peixes adultos. O artigo em vídeo apresentado neste manuscrito demonstra os procedimentos para um novo modelo de indução AKI utilizando uma injeção i.p. de 120 ug cisplatina por g de animal (120 μg/g) (Figura 2A). Esta dose foi inicialmente baseada em estudos de AKI induzidos por cisplatina em modelos murinos que foram em torno de 10 mg/kg (equivalente a 10 μg/g)14,15,16,17, no entanto, esta dose não foi suficiente para induzir danos renais relacionados à nefrotoxicidade (dados não apresentados). Assim, aumentamos a dose para as utilizadas neste estudo (Figura 2B). Nosso trabalho revelou um efeito dependente de dose de cisplatina na taxa de sobrevivência após injeção com indução de danos no tecido renal 24 hpi, como mostrado pela perda de estrutura tubular, aumento do infiltrado inflamatório e alta taxa de morte celular. Aqui, descrevemos duas técnicas para analisar o desenvolvimento de AKI induzido por cisplatina: citometria de fluxo, para analisar a infiltração celular, e TUNEL, para medir a morte celular. A citometria de fluxo é uma tecnologia que mede as características física (tamanho e granularidade) e química (compostos fluorescentes) das células. Dentro do cítmetro, a suspensão celular passa por um fluido de baia que organiza as células em uma única linha, permitindo que elas passem por um raio laser uma célula de cada vez(Figura 3A). Um detector na frente do feixe de luz medirá a Dispersão Dianteira (FSC), que se correlaciona com o tamanho da célula, e os detectores para o lado medirão a Dispersão Lateral (SSC) que se correlaciona com a granularidade das células. Outros detectores medirão a fluorescência de partículas, proteínas fluorescentes ou células rotuladas por anticorpos39,40. Como os anticorpos comerciais para zebrafish são escassos hoje em dia, o uso de repórteres animais e biomarcadores fluorescentes permite melhorar essa análise e identificar diversas populações celulares41,42,43. Outra ferramenta utilizada neste protocolo foi o ensaio Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL). O ensaio TUNEL é um método de detecção de apoptose em estágio final que se baseia na capacidade do TdT de identificar DNA fragmentado e rotulá-lo com desoxiú-nostítides marcados com um marcador fluorescente que mais tarde pode ser visualizado e quantificado pela microscopia44 (Figura 3B). Considerando que uma das características mais marcantes da AKI é a indução da apoptose nas células renais tubulares3, esta técnica é extremamente vantajosa, pois pode ser analisada por citometria de fluxo e/ou microscopia.

As abordagens apresentadas neste artigo permitem a observação do status AKI e oferecem um novo modelo agudo para estudar distúrbios AKI que podem ser úteis para a pesquisa de novos alvos terapêuticos na AKI relacionada à cisplatina.

Protocol

Os procedimentos descritos neste protocolo foram previamente aprovados para serem utilizados no modelo de zebrafish pelo Comitê de Ética do Uso animal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. 1. Indução AKI por Injeção Intraperitoneal cisplatina Prepare a solução de trabalho cisplatina diluindo a solução de estoque para 850 μg/mL em 0,9% NaCl. Mantenha-se em temperatura ambiente, protegido da luz.ATENÇÃO: O tecido recomenda a manipulação da cisplatina com equipamentos de proteção individual (EPI), incluindo óculos, luvas e jaleco. Armazene a solução de estoque em temperatura ambiente, protegida da luz. Prepare 150 mg/L MS-222 (Tricaine) anestésico em água do sistema45. Anestesiar o zebrafish adulto (5-9 meses) por imersão por aproximadamente 1-2 min.NOTA: Peixes anestesiados efetivamente devem ser irresponsivos ao toque. Para testar anestesia eficaz, pressione suavemente a barbatana caudal para observar a reação.ATENÇÃO: Tricaine é um irritante para a pele e olhos, use EPI para manipular. O uso de uma colher de plástico transfira o peixe para uma superfície absorvente, como toalhas de papel, para remover o excesso de água ao redor do corpo. Em seguida, com a colher de plástico transfira o peixe para uma placa de Petri sobre uma balança e pese o peixe. Tome nota do peso do peixe, pois será necessário para os cálculos das doses.NOTA: Absorver o excesso de água dos peixes evita superestimar o peso do animal, não seque demais, pois prejudica o peixe. Para alcançar a dose final de 120 μg/g de peso, dividir o μg da dose final (120 μg) por μg da solução de trabalho cisplatina (850 μg) e converter este número em microliters (μL) multiplicando-se por 1000, para obter o volume de 120 μg de cisplatina (141,2 μL). Em seguida, multiplique esse número (141,2 μL) para o peso do peixe (g) para obter o volume final a ser injetado. Com uma colher de plástico, transfira o peixe em uma esponja molhada com um pequeno corte para segurá-lo, com o lado ventral para cima. A esponja deve estar molhada com anestésico na água do sistema. Encha uma seringa de insulina de 31 G 1,0 mL com o volume calculado de solução de trabalho cisplatina. Insira a agulha na porção intraperitoneal do animal perto da barbatana pélvica, em um ângulo raso para evitar perfurar as vísceras(Figura 2A). Em seguida, injete lentamente a solução. Após a injeção coloque o peixe em um tanque para se recuperar da anestesia. Observe os peixes em busca de sinais de recuperação normal (por exemplo, movimentos de natação, movimentos operculares).NOTA: O animal deve se recuperar nos próximos 3-5 min. Se necessário, estimule o peixe movendo-o com uma colher de plástico, uma pipeta de plástico Pasteur, ou colocando-o perto de uma mangueira com bolhas. Para o peixe de controle, realize o mesmo procedimento injetando uma solução de 0,9% de NaCl. Use o mesmo cálculo seguindo a proporção do peso corporal: o volume a ser injetado será de 141 μL multiplicado pelo peso do peixe (g). Monitore a sobrevivência dos peixes pelo menos duas vezes por dia nos dias seguintes(Figura 2B). 2. Isolamento renal e processamento de tecidos para citometria de fluxo de células imunes Para este procedimento, utilize animais transgênicos marcados por células imunes(por exemplo,Tg (mpo:GFP). Após 24 hpi de 120 μg/g cisplatina, eutanize os animais por choque hipotérmico (resfriamento rápido).NOTA: O choque hipotérmico demonstrou ser mais eficaz como método de eutanásia do que a overdose de MS-222. O choque hipotérmico é menos estressante, rápido, consistente e mais seguro para o pessoal do que o uso da MS-222, descreveu anteriormente46,47. Em um tanque de travessia exterior prepare a água gelada em uma proporção de 5:1 de gelo para água do sistema, coloque o tanque interno com uma tela sobre o gelo, espere até que a água atinja 2-4 °C.NOTA: Os peixes não devem estar em contato direto com o gelo, pois isso pode causar queimaduras térmicas e dor. Transfira animal para água gelada, espere pelo menos 10 minutos até que haja perda de orientação e sem movimento opercular. Com uma colher de plástico, coloque o peixe em toalhas de papel para secar o excesso de água. Transfira o peixe para uma placa de dissecção de 3% e leve-o sob um estereóscópio com luz superior. Com uma tesoura, decapitar peixes fazendo um corte rápido logo atrás dos olhos, e remover a cabeça. Com uma tesoura fina faça um corte do lado aberto para a cloaca e remova os órgãos internos com fórceps finos. Use pinos de inseto para beliscar as laterais das paredes do corpo para abrir a carcaça e expor o rim preso à espinha dorsal. Retire o rim com fórceps finos e coloque o órgão em uma placa de 6 poços com uma solução fria de 1x PBS/2% FBS. Mantenha-se no gelo. Pegue o tecido com uma pipeta de plástico Pasteur e passe o tecido através de um coador de células de 40 μm sobre um tubo de 50 mL, macerando-o suavemente com um êmbolo de seringa. Lave duas vezes com 1 mL de 1x PBS/2% FBS e colete as células em um tubo de 50 mL. Centrífugas a 400 × g por 5 min a 4 °C. Pegue cuidadosamente todo o supernatante com uma micropipette de 1 mL e descarte-a. Adicione 500 μL de PBS frio 1x para resuspensar as células e colocá-las em tubos de citometria de fluxo de 5 mL. Mantenha-se no gelo. Conte células na câmara de Neubauer fazendo uma diluição de 1:10 em Trypan Blue(por exemplo, pegue 10 μL da amostra e misture com 90 μL de Trypan Blue). Adicione 10 μL da mistura a uma câmara de Neubauer e conte células sob o microscópio.NOTA: São esperados resultados ótimos com 1-5 x 106 células/mL e viabilidade >80%.ATENÇÃO: O azul trypan é um agente cancerígeno, use EPI para manusear. Leve as células para serem lidas por um citómetro. Em seguida, analise os resultados selecionando a população de interesse. 3. Processamento de tecido renal de zebrafish adulto para ensaio tunel Para este procedimento, utilize animais de tipo selvagem (por exemplo,AB, Tübingen, etc.) ou um animal transgênico com cor fluorescente diferente do kit TUNEL, pois fluorescência semelhante pode interferir na análise do TUNEL. Após 24 hpi de 120 μg/g cisplatina, eutanize os animais por choque hipotérmico (resfriamento rápido). Veja 2.3-2.4. Dissecar o peixe conforme descrito em 2.5-2.6; o rim deve permanecer preso à espinha dorsal durante o procedimento de fixação (explicado abaixo). Usando pinos de inseto, belisque as laterais das paredes do corpo para abrir a carcaça e fixá-la em uma superfície de rolha para manter o rim exposto.NOTA: Este procedimento garante que o rim permaneça na posição certa para análise posterior. Em seguida, coloque a superfície da rolha com o rim voltado para baixo em uma placa de poço 6 sobre uma solução recém-feita de 4% de paraformaldeído (PFA). Mantenha-o durante a noite a 4 °C.ATENÇÃO: O PFA é cancerígeno e irritante para superfícies de pele e mucosa. Prepare soluções PFA sob uma capa química usando EPI, incluindo equipamentos de proteção ocular. No dia seguinte, disseca os rins como em 2.8. Coloque os rins em uma placa de Petri de 60 mm com 1x PBS e enxágue duas vezes em 1x PBS. Prepare 2% de agarose para gerar uma matriz de suporte para o tecido. Descarte todos os 1x PBS restantes da placa de Petri e despeje 2% de agarose lentamente para cobrir todo o órgão. Em seguida, posicione o rim usando fórceps finos sob um estereótipo para evitar que o rim dobre. Deixe agarose solidificar à temperatura ambiente.NOTA: Este procedimento manterá a orientação e a forma do órgão através do processamento histológico, uma vez que a forma semelhante à folha do órgão causa uma tendência a dobrar se não estiver dentro de uma matriz de apoio. Após a solidariedade da ágarose, use um bisturi para cortar a agarose ao redor do tecido, formando cubos pequenos, e remover o excesso de agarose ao redor do tecido. Coloque os cubos de agarose em uma fita adequada para processamento histológico.NOTA: As seguintes etapas podem ser feitas manualmente ou em um processador automático de tecido. Primeiro, processe o tecido no seguindo os próximos passos por 45 min cada um em temperatura ambiente: um banho de 50% de etanol, um banho de 70% de etanol, dois banhos consecutivos de 95% de etanol e três banhos consecutivos de 100% de etanol. Depois, processe o tecido em dois banhos consecutivos de xileno e três banhos consecutivos de parafina; este último dura 1 hora cada a 60 °C.ATENÇÃO: Faça alterações sob uma capa química, vapores de etanol e xileno são irritantes e tóxicos. Para preparar blocos de parafina, derreta as lentilhas de parafina a 60 °C. Abra o de plástico com o tecido dentro e mantenha-o em uma placa quente. Aqueça moldes de metal para a parafina. Com pinças coloque o tecido sobre um molde de metal para que o comprimento do rim seja paralelo à base de moldes. Adicione a parafina, remaneque o tecido se necessário. Cubra o molde com a base do e adicione parafina até que a grade esteja coberta. Deixe solidificar à temperatura ambiente e, em seguida, coloque a -20 °C para um processo de solidificação mais rápido. Solte o bloco de parafina do molde de metal cerca de 20-30 minutos depois. Com um microtome, se sectionia o tecido embutido na parafina até 5 μm de espessura. Use lâminas de vidro silanizadas ou carregadas positivamente para coletar o tecido. 4. Ensaio TUNEL NOTA: O protocolo a seguir usa um Kit de Detecção de Morte de Célula In Situ (Tabela de Materiais). Deslizamentos de tecido de cera colocando-os em dois banhos consecutivos de xileno por 5 minutos. Em seguida, reidratar o tecido através de uma série de etanol classificado: 100%-95%-70%-50%, para 5 min cada. Coloque slides na água da torneira fria para enxaguar o etanol. Mantenha os slides em água destilada. Prepare uma câmara de incubadora escura. Adicione toalhas de papel molhadas na parte inferior para manter a umidade durante as etapas de incubação.NOTA: Na falta de uma câmara de incubadora é possível usar uma placa de Petri com papel úmido na parte inferior e dois palitos de dente para colocar o slide. Prepare a solução de trabalho Proteinase Kfresca: 10 μg/mL em 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8.NOTA: Proteinase K é usado como um agente de permeabilização, conforme recomendado pelo tecido. Coloque os slides na câmara de incubadora escura e adicione a solução de trabalho Proteinase K até cobrir amostras. Incubar por 30 min a 37 °C. Enquanto as amostras estão incubando, prepare a mistura de reação TUNEL: Adicione 50 μL de Solução de Enzima à Solução de Etiqueta de 450 μL. Proteja-se contra a luz.NOTA: O volume a ser preparado pode ser ajustado na mesma proporção de 1:10. O volume é calculado para 50 μL da mistura para cada seção; isso pode mudar dependendo do tamanho das amostras. Pegue a câmara escura e lave os slides duas vezes com 1x PBS. Em seguida, seque a região ao redor da amostra usando papel absorvente e adicione 50 μL de mistura de reação TUNEL sobre cada lâmina de tecido, espalhe a solução para que toda a amostra seja coberta. Incubar a 37 °C por 2 h. Proteja-se contra a luz. Após a incubação, enxágue o slide três vezes com 1x PBS e seque a região ao redor da amostra usando toalhas de papel. Adicione 50 μL de DAPI 1:1000 às amostras, para contra-retenção nuclear, e incubar por 5 minutos à temperatura ambiente. Proteja-se contra a luz. Enxágüe novamente três vezes com 1x PBS e seque a região ao redor da amostra. Monte o slide com um meio hidrofílico anti-fade, coloque uma mancha de cobertura e sele com esmalte. Armazene lâminas horizontalmente, protegidas da luz a 4 °C.NOTA: As propriedades anti-desbotadas do meio de montagem são para preservar a fluorescência das amostras, mas é possível usar qualquer meio hidrofílico disponível. A etapa final de vedação com esmalte é crucial para evitar a desidratação. Visualize as amostras sob um microscópio de fluorescência. Para este tipo de pigmento fluorescente, use um comprimento de onda de excitação na faixa de 520-560 nm (verde) e detecção na faixa de 570-620 nm (vermelho).

Representative Results

O rim do zebrafish é um órgão pigmentado plano localizado na parede dorsal e sua unidade funcional básica, o nefron, é conservada com mamíferos(Figura 1). A particularidade de ter apenas um rim com alta capacidade de regeneração faz deste organismo modelo uma excelente escolha para lesão renal modelo. Os protocolos apresentados neste trabalho são projetados para induzir aki pela injeção intraperitoneal (i.p.) de cisplatina em zebrafish adulto(Figura 2) e posteriormente ser analisada por duas técnicas detalhadas antes: citometria de fluxo(Figura 3A) e TUNEL (Figura 3B). Um fluxograma de todo o processo é retratado na Figura 4. As doses de cisplatina foram aplicadas com base inicialmente nas descritas nos modelos de camundongos15,16,17, em que o padrão utilizado é de 10-13 mg de cisplatina por kg de animal (mg/kg). No entanto, o zebrafish mostrou-se mais resistente à cisplatina do que o rato (dados não mostrados), e a dose final foi aumentada. Quando avaliamos a taxa de sobrevivência dos animais, os experimentos mostraram um efeito dependente de dose de cisplatina(Figura 5A). Por isso, recomendamos seguir as instruções exatamente como explicado neste protocolo e monitorar a taxa de sobrevivência dos animais constantemente como medida de reprodutibilidade, antes de coletar qualquer material. Após a injeção i.p. de 120 μg/g cisplatina (Figura 5A, linha vermelha), observou-se uma diminuição na sobrevida de cerca de 30% dos animais nas primeiras 24h e a sobrevida diminuiu gradualmente até atingir cerca de 20% dos animais vivos no dia 5 pós-injeção, depois estabilizada(Figura 5A). A toxicidade da cisplatina não foi afetada pelo sexo dos animais, uma vez que machos e fêmeas têm curvas de sobrevivência semelhantes(Figura 5B). A análise da cinética da AKI induzida por cisplatina mostrou aumento da inflamação e morte celular no rim 24 hpi. Uma das formas mais rápidas e quantitativas de avaliar a inflamação é a citometria de fluxo, mas dada a falta de anticorpos contra antígenos de zebrafish disponíveis comercialmente para esta técnica, é necessário usar uma linha transgênica com um marcador imunológico. Atualmente, muitas linhas de zebrafish rotulando células imunes são acessíveis(Tabela 1). Estas linhas podem ser usadas de forma cansa ou em combinação, dado repertório suficiente para análise48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60. Isso simplifica enormemente a técnica, uma vez que não é necessário qualquer etapa de incubação de anticorpos, pelo contrário, após o isolamento das células por separação mecânica, a leitura direta no cítmetro é possível. Como mencionado anteriormente, o rim do zebrafish não é apenas um órgão de filtragem de sangue com funções homeostáticas, mas também o local anatômico de hematopoiese em adultos, equivalente à medula óssea em mamíferos33,34,35. Dessa forma, quando o analisamos por citometria de fluxo é possível diferenciar populações celulares comparáveis ao sangue humano61,62 (Figura 6A), isso nos permite identificar as populações celulares inicialmente por tamanho e granularidade e excluir detritos. Neste caso, utilizamos uma linha transgênica chamada Tg(mpo:GFP)52 que expressa uma proteína fluorescente verde (GFP) juntamente com a enzima mieloperoxidase, que está presente em neutrófilos. Sabendo disso, nossa estratégia de portão foi baseada na separação inicial da população do granulocito (Figura 6B). Após isso, as células doublet foram excluídas, pois podem alterar significativamente a análise e levar a conclusões imprecisas. Um doublet é um único evento que consiste em 2 partículas independentes e pode ser excluído selecionando uma altura de dispersão para a frente (FSC-H) vs. uma área de dispersão para a frente (Figura6C). Após esta etapa, as células que expressavam o marcador fluorescente foram identificadas e selecionadas(Figura 6D). Por fim, as estatísticas populacionais foram extraídas da análise e traçadas como percentual de células (Figura 6E). Uma das características mais proeminentes da nefrotoxicidade cisplatina é a morte celular tubular10, e para visualizar facilmente isso usamos o ensaio TUNEL para detecção de apoptose. Este método recomenda o uso de células e tecidos do tipo selvagem que não possuem marcadores fluorescentes, uma vez que a fluorescência paralela interferiria na análise, no caso do zebrafish é recomendado usar linhas do tipo selvagem, como AB, Tübingen, TAB, ou uma linha transgênica com uma proteína fluorescente que não interfere na cor da fluorescência TUNEL. A técnica TUNEL permite a análise através de citometria de fluxo ou microscopia. A microscopia tem a vantagem de conservar a estrutura tecidual, permitindo ver quais células estão morrendo. Sob o microscópio fluorescente, os núcleos brilhantes das células apoptóticas podem ser facilmente diferenciados do fundo. Os animais injetados com cisplatina (Figura 7B) têm mais células mortas do que o controle (Figura 7A) a 24 hpi. A quantificação final foi feita com a opção de contador celular do Software FIJI e mostrou estatisticamente mais células mortas em rins tratados com cisplatina do que nos controles(Figura 7C) O protocolo descrito neste manuscrito mostrou como usar cisplatina como indutor de AKI em zebrafish adulto, que é dose-respondente, rápido e confiável. Com base nos dados obtidos a partir das taxas de sobrevivência e da medição de sinais de nefrocoxicidade da cisplatina incluindo inflamação (detectada por citometria de fluxo) e morte celular (detectada pelo ensaio TUNEL), propomos este modelo para o estudo da nefrotoxicidade cisplatina, bem como para futuros tratamentos em doenças relacionadas àKI. Figura 1: Estrutura e comparação de zebrafish e rins humanos. A. (1) Vista lateral de um zebrafish adulto com o rim representado em marrom escuro localizado na parede dorsal do peixe, entre a bexiga de natação (sb) e a espinha dorsal. (2) Visão ventral do rim mostrando nefrões (amarelo) conectados ao duto coletor (azul). As diferentes regiões do rim são sinalizadas: cabeça (H), tronco (Tr) e cauda (Ta). (3) Esquemático representando nefrrons de zebrafish e seus segmentos rotulados e coloridos para combinar regiões conservadas genéticas com nefron humano. B. (1) Visão sagital de um rim humano. (2) Esquema representando um nefron humano com segmentos rotulados e coloridos. RC: corpúsculo renal; PCT: túbulo convolucido proximal; PST: túbulo reto proximal; TL: membro fino; LH: Loop de Henle; TAL: membro ascendente espesso; DE: distal cedo; DL: distal tardio; DCT: túbulo distal convolutado; CD: coletor de duto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Design experimental para AKI induzido por cisplatina. A. Visão lateral e ventral de zebrafish adulto apontando a posição da agulha durante o procedimento de injeção. A agulha penetra em um ângulo de 20-30° da barriga e é inserida lentamente paralelamente à parede ventral evitando perfurar as vísceras. B. Design experimental de AKI induzido por cisplatina: (1) Injeção de cisplatina 120 μg/g por animal no dia zero. (2) Antes de tentar a etapa 3, recomenda-se o monitoramento de sobrevivência dos peixes após a injeção desde o primeiro dia até o décimo dia. (3) Dissecções renais um dia após a injeção de cisplatina para novas técnicas de processamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Mecanismos de citometria de fluxo e técnicas tunel. A. Visão geral do citómetro de fluxo: uma suspensão de células é hidrodinamicamente focada em uma única linha por um fluido de baia, fazendo com que as células passem uma a uma na frente de um raio laser. Os detectores na frente e na lateral medem a dispersão dianteira (FSC), a dispersão lateral (SSC) e a fluorescência das células. B. Princípio do ensaio TUNEL. O terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) media a adição de um dUTP marcado por fluorescentes a extremidades de 3′-OH de um DNA fragmentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Fluxograma de técnicas representadas. A. Um fluxograma mostrando os passos a seguir ao optar por analisar o tecido renal através da citometria de fluxo (laranja) ou TUNEL (azul), ao induzir AKI por injeção de cisplatina (cinza). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Monitoramento de sobrevivência de peixe injetado cisplatina. A. Taxa de sobrevivência de diferentes doses de injeções de cisplatina (25 – 50 – 112,5 – 120 μg/g). Teste de log-rank (Mantel-Cox), ** p < 0,01. B. Taxa de sobrevivência de machos vs. fêmeas injetadas com cisplatina de 120 μg/g. Teste de log-rank (Mantel-Cox), *** p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Estratégia de portão para linha de zebrafish transgênico. A. Parcela de densidade de células renais adultas de zebrafish, as populações são separadas por tamanho (FSC-A) e granularidade (SSC-A). Diferentes populações são selecionadas por ovais/círculos coloridos. Rosa: Erythroid; Preto: Linfoide; Amarelo: Precursores; Granulocitos. B. Parcela de densidade da área de dispersão lateral (SSC-A) e área de dispersão para a frente (FSC-A) para seleção da população de granulócitos no rim. C. Gráfico de densidade de dispersão para a frente alta (FSC-H) e área de dispersão para a frente (FSC-A) para seleção de população de singlets dentro do portão de granulocito. D. Gráfico de densidade da área de dispersão para a frente (FSC-A) e FITC-A:MPO para seleção de células positivas mpo:GFP (neutrófilos) no rim. Uma população positiva é considerada em torno de10 3 em, de intensidade de fluorescência. E. Gráfico da porcentagem de células positivas mpo:GFP (neutrófilos) em Control vs. Cisplatin animais, 24 hpi . Teste tnão não pago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Ensaio TUNEL de peixe injetado cisplatina. A. Microfotogramas de rim adulto fixo 24 h após 120 μg/g injeção de cisplatina. Os controles são injetados com 0,9% de NaCl. As células positivas tunel (células apoptóticas) estão manchadas em vermelho (setas brancas). DAPI (azul) é usado como contra-mancha nuclear. Barra de escala: 50 μm. 20x de ampliação. B. Gráfico mostrando quantificação do número de células mortas no rim por campo de 20x. T-teste nãopago, * p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Linha Transgênica Tipo de célula rotulado Referências Tg(spi1:EGFP)pA301 Células mieloides Ward et al. 200348 Tg(zpu1:GFP) Células mieloides Hsu et al. 200449 Tg(mhc2dab:GFP)sd6 Monócitos Wittamer et al. 201150 Tg(lysC:DsRED2) Neutrófilos Hall et al. 200751 Tg(mpo:GFP) Neutrófilos Mathias et al. 200652 Tg(mpeg1:mCherry) Macrófagos Ellett et al. 201153 Tg(mpeg1:Dendra2) Macrófagos Harvie et al. 201354 Tg(lck:GFP) Células T Langenau et al. 200455 TgBAC(ikaros:EGFP) Células T Bajoghli et al. 200956 Tg(rag1:GFP) Células T Jessen et al. 199957 Tg(rag2:GFP) Células T Jessen et al. 200158 Tg (CD79:GFP) Células B Liu et al. 201759 Tg(CD45:DsRed) Leucócitos Bertrand et al. 200860 Tabela 1: Linhas transgênicas de zebrafish para células imunes. Tabela retomando os nomes das linhas de repórteres de zebrafish com o respectivo tipo de célula imune rotulada e os artigos de referência onde foram construídos. Uma combinação dessas linhas de zebrafish pode oferecer novas possibilidades de seleção celular por citometria de fluxo.

Discussion

A prevalência de doença renal continuou a aumentar em todo o mundo, tornando-se um problema global de saúde pública que afeta milhões de pessoas63. Encontrar uma maneira de tratar indivíduos com lesões renais é de suma importância, bem como entender mais sobre sua etiologia e progressão. Vários estudos têm usado modelos animais para entender danos renais. O rim de zebrafish (Figura 1) tem sido estudado há anos em biologia do desenvolvimento e pesquisa de lesões devido às suas capacidades auto-regeneradoras e similaridade genética29,64. Aqui, apresentamos um novo modelo AKI em zebrafish adulto utilizando as propriedades da cisplatina como agente nefrotóxico, detalhando os passos para a realização de uma reação rápida e aguda com dano visível assim que 24 hpi(Figura 2). Além disso, explicamos aqui duas técnicas que ajudarão na avaliação dos danos teciduais após a injeção de cisplatina, citometria de fluxo e TUNEL (Figura 3).

Os modelos atuais de AKI em zebrafish adulto incluem a injeção i.p. de gentamicina que induz danos extensos na destruição de nefron e túbulos, eventos de neonefitrogênios a partir do dia 5, e a regeneração é concluída em 21 dias após a injeção65. Por outro lado, um modelo de lesão renal aguda associada à sepse (S-AKI) foi estabelecido pela infecção com Edwardsiella tarda, uma vez que aumentou significativamente a expressão de marcadores AKI, como insulina-como insulina fator de crescimento-vincula protein-7 (IGFBP7), inibidor de tecido de metaloproteinases 2 (TIMP-2), e molécula de lesão renal-1 (KIM-1), em larvas e zebrafish adulto66. O zebrafish é conhecido por ser um animal de alto rendimento para a busca de agentes terapêuticos e isso inclui o uso de probióticos e metabólitos derivados de microbiota para estudar a função renal e a regeneração67. No entanto, os modelos disponíveis podem afetar diretamente o resultado desses tratamentos. Assim, estabelecemos um método diferente para induzir aki em zebrafish adulto(Figura 4), utilizando cisplatina como um agente nefrotóxico conhecido conhecido que não teria efeitos conhecidos diretos sobre a microbiota do peixe, assim como o modelo de gentamicina por ser um antibiótico, ou a infecção com E. tarda,por ser um modelo de sepse. No entanto, ao mesmo tempo em que estávamos desenvolvendo nosso protocolo de cisplatina, outro grupo também explorou os efeitos nefrotóxicos da cisplatina em zebrafish adulto, simplificando a dose para 10-20-30 μg por animal68. Embora também tenham mostrado efeito dependente de dose de cisplatina na sobrevida, recomendamos cautela no uso de uma única quantidade de cisplatina para todos os peixes, pois o zebrafish da mesma idade pode ter tamanhos e peso muito diferentes e isso poderia induzir variações nos resultados69,70. Achamos importante ajustar a dose ao peso correspondente do animal, como é feito em camundongos e neste estudo.

Em nossos experimentos com zebrafish adulto, cisplatina mostrou um efeito dose-resposta. Isso foi visualizado pelo monitoramento da taxa de sobrevivência dos animais após a injeção de cisplatina(Figura 5). Utilizamos a sobrevivência como forma de estimar a intensidade da dose de cisplatina e não como medida de nefrotoxicidade, pois nenhum outro sinal físico é visível durante o tempo de monitoramento. Isso pode ser comparável com os roedores, nos quais a gravidade da lesão renal pode ser modulada pela dosagem e frequência da injeção de cisplatina15, alcançando doses letais com maiores concentrações de cisplatina71. Morto também é visto nos dias seguintes no modelo larval de cisplatina72. Como nosso objetivo era induzir uma lesão aguda em poucos dias, selecionamos a dose de 120 μg/g de cisplatina como é possível observar danos nos rins 24h após a injeção, porém, isso pode ser ajustado dependendo dos objetivos do estudo.

Em humanos, a AKI é clinicamente diagnosticada pela diminuição da taxa de filtração glomerular (RSG), creatinina sérea elevada e nitrogênio de ureiasanguínea 3. No zebrafish, o repertório de modelos AKI inclui alguns modelos genéticos condicionais73,74 e alguns modelos relacionados com drogas65,72, mas como alguns dos parâmetros funcionais AKI não podem ser medidos em zebrafish por causa de dificuldades técnicas(por exemplo, coleta de sangue), a maioria das pesquisas adota técnicas morfológicas e visuais para observar as características do AKI1,75, como nosso estudo.

Nos roedores, a cisplatina entra nas células epiteliais nos túbulos proximais e distais, dentro da célula sofre ativação metabólica e torna-se altamente reativa atuando em organelas celulares e induzindo alterações na estrutura celular. Essas alterações podem induzir apoptose e autofagia e até necrose, em doses muito altas. Em resposta a este dano, muitas citocinas são liberadas e leucócitos são recrutados levando à inflamação e afetando a funcionalidade do órgão15. Isso destaca a importância de avaliar que tipo de células podem ser encontradas no rim ferido, como residentes ou células imunes infiltradas. Aqui mostramos como avaliar isso por citometria de fluxo, utilizando as linhas de repórteres imunes transgênicas disponíveis hoje(Tabela 1). A cisplatina aumentou o percentual de neutrófilos (células positivasmpo:GFP) no rim 24 h após a injeção(Figura 6). No caso do zebrafish, o rim é o nicho de HSCs que dão origem a diferentes tipos de células sanguíneas. No entanto, muitos granulócitos e macrófagos normalmente circulam no sangue. Em nosso exemplo, utilizamos a linha transgênica mpo:GFP que expressa GFP sob o promotor de mieloperoxidase de neutrófilos52. Estudos originais da linha transgênica mpo:GFP demonstraram expressão de mieloperoxidase em diferentes estados de maturação de neutrófilos76, mas nossa estratégia de portão se concentrou na fração de granulocito que compreende células maduras provenientes do sangue52, desta forma nossa análise inclui células infiltradas e não células residentes. Isso é importante considerar quando isolar a população celular desejada.

Como explicado acima, a apoptose é o marcador mais clássico do AKI relacionado à cisplatina. Aqui, demonstramos um protocolo simples para a localização de células mortas pelo ensaio TUNEL. A injeção de cisplatina aumentou o número de células apoptóticas de 24 hpi (Figura 7). Isso pode ser facilmente quantificado contando diretamente as células mortas do tecido. No entanto, para a identificação de mortes específicas de células, o uso de anticorpos contra a célula desejada (por exemplo, células tubulares), ou o uso de uma linha de repórter transgênico pode ser usado em conjunto com essa técnica. Quando comparada com o modelo induzido pela gentamicina de AKI, a cisplatina parece ser um modelo mais severo, uma vez que a apoptose de gentamicina foi maior no terceiro dia após a injeção65.

Apesar de ter uma variedade de efeitos colaterais, a cisplatina ainda é amplamente utilizada na terapia contra o câncer, devido à sua eficácia contra vários tipos de câncer, incluindo carcinomas, tumores de células germinativas, linfomas e sarcomas77. A nefrocoxicidade ocorre em um terço dos pacientes em tratamento com cisplatina10,portanto, a busca por estratégias que possam diminuir esse efeito e aumentar a proteção é imperativa. Acreditamos que os métodos e técnicas apresentados neste manuscrito ajudarão a elucidar mecanismos de lesão renal e encontrar alvos terapêuticos que possam ser essenciais para melhorar a qualidade de vida dos indivíduos que sofrem de complicações renais, predominantemente as relacionadas ao uso de cisplatina.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A pesquisa foi apoiada pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), código financeiro 001. Agradecemos aos colaboradores do Laboratório de Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno e da Instalação zebrafish do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Agradecemos a Cristiane Naffah de Souza Breda e Theresa Raquel de Oliveira Ramalho pelos comentários e sugestões sobre o manuscrito. Agradecemos muito e agradecemos a Marcio Villar Martins, da equipe multimídia do Instituto de Ciências Biomédicas, pela gravação, edição e produção deste vídeo.

Materials

1x PBS Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water
31 G 1.0 cc insulin syringe BD Plastipak 990256 Needle: BD Precision Glide 300110
3.5 L Fish tank Tecniplast Part of the aquactic system
6 well plate Corning 351146
10 mM Tris/HCl Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)
50 ml Falcon tube Corning 352070
2-3% Agarose Invitrogen 16500-500 Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.
2% FBS Gibco 12657-09 Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS
4% Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C
50% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
70% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
90% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
100% Ethanol Synth 00A1115.01.BJ
100% Xylene Synth 00X1001.11.BJ
Cell strainer 40 µm Corning 431750
Cisplatin Blau Farmacêutica 16020227 C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.
Cork board sheet Obtained from local stationary store
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Stock solution 20 mg/ml dissolved in water
Fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Flow cytometry tubes Corning 352052
Glass slide Thermo-Fisher 4445
Histology cassette Ciencor 2921
Immuno stain chamber Ciencor EP-51-05022
Incubator NAPCO 5400 Set to 37 °C
Insect pins Papillon Model micro15x20
In Situ Cell Death Detection Kit Roche Diagnostics 12156792910
Metal mold Leica Biosystems 3803081
Micropipette 200-1000 µL Eppendorf Use 1 mL tips
MS-222 (Tricaine) Fluka Analytical A5040-25G
NaCl 0.9% Synth C1060.01.AG Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water
Nail polish Prefer transparent
Neubauer chamber Precicolor HGB
Pasteur plastic pipet United Scientific Supplies P31201
Paraplast Sigma-Aldrich P3558
Petri dish J.ProLab 0307-1/6 60 and 100 mm
Plastic spoon Obtained from local store
Proteinase K New England BioLabs P8102 Diluite from stock 20 mg/ml
Scissors Fine Science Tools 14060-09
Scalpel blade Solidor
Sponge Obtained from local store
Trypan Blue Cromoline 10621/07
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10
Centrifuge Eppendorf 5810R
Cytometer BD Biosciences FACSCanto II
Fluorescence Stereoscope Zeiss Axio Zoom.V16
Fluorescence Microscope Zeiss AxioVert.A1
Microtome Leica Jung Supercut
Scale Ohaus Corporation AR2140
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Morales Fénero, C., Padovani, B. N., do Amaral, M. A., de Barros, G. J. B., de Oliveira, I. K. X., Hiyane, M. I., Camâra, N. O. S. Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e61575, doi:10.3791/61575 (2021).
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