JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Острая модель травмы почек, вызванная Цисплатином у взрослых зебрафиш

Published: May 15, 2021
doi:
10.3791/61575
, , , , , ,
1Department of Immunology,University of São Paulo, 2Department of Medicine, Nephrology Division,Federal University of São Paulo

Summary

Этот протокол описывает процедуры, чтобы вызвать острую травму почек (AKI) у взрослых зебры с использованием цисплатина в качестве нефротоксического агента. Мы подробно шаги для оценки воспроизводимости техники и два метода для анализа воспаления и гибели клеток в почечной ткани, цитометрии потока и TUNEL, соответственно.

Abstract

Цисплатин обычно используется в качестве химиотерапии. Хотя он имеет положительный эффект у людей, лечения рака, цисплатин может легко накапливаться в почках из-за его низкой молекулярной массы. Такое накопление приводит к гибели трубчатых клеток и может вызвать развитие острой травмы почек (АКИ), которая характеризуется быстрым снижением функции почек, повреждение тканей и проникновение иммунных клеток. При введении в определенных дозах цисплатин может быть полезным инструментом в качестве индуктора AKI в животных моделях. Зебрафиш появился в качестве интересной модели для изучения функции почек, регенерации почек и травм, так как почечные структуры сохраняют функциональное сходство с млекопитающими. Взрослые зебры, введенные с цисплатином показывает снижение выживаемости, гибель клеток почек, и увеличение маркеров воспаления после 24 ч после инъекции (hpi). В этой модели инфильтрация иммунных клеток и гибель клеток могут быть оценены с помощью цитометрии потока и анализа TUNEL. Этот протокол описывает процедуры, чтобы вызвать АКИ у взрослых зебры путем внутриперитонеальной инъекции цисплатина, а затем демонстрирует, как собрать почечную ткань для обработки цитометрии потока и клеточной смерти TUNEL анализа. Эти методы будут полезны для понимания последствий цисплатина как нефротоксического агента и будут способствовать расширению моделей AKI у взрослых зебр. Эта модель также может быть использована для изучения регенерации почек, в поисках соединений, которые лечат или предотвращают повреждение почек и для изучения воспаления в АКИ. Кроме того, методы, используемые в этом протоколе улучшит характеристику повреждения тканей и воспаления, которые являются терапевтическими целями в связанных с почками сопутствующих заболеваний.

Introduction

Почки отвечают за несколько важных физиологических функций, которые поддерживают гомеостаз, такие как фильтрация крови, удаление избыточных остатков, и регулирование концентрацийионов 1. Повреждение почечной ткани может привести к неоднородным состоянием, называемому Острая травма почек (AKI), который клинически описывается как быстрое снижение функции почек, вызванное разрушением и смертью трубчатых эпителиальных клеток, эндотелиальной травмы клеток, и проникновение лейкоцитов 2,3. AKI является условием, по прогнозируется, произойдет в 8-16%госпитализации 4, с высоким уровнем смертности, который колеблется от 20 до 50% в отделении интенсивной терапии (ICU)5. Этот недуг связан с увеличением пребывания в больнице и значительным использованием финансовыхресурсов 5. Этиологические факторы включают обезвоживание, шок, инфекции, сепсис, сердечно-сосудистые заболевания, и нефротоксические препараты6. Нефротоксичность определяется как почечная травма, вызванная наркотиками, вызывая эффекты, как АКИ, тубулопатии, и glomerulopathies7. Нефротоксичность затрагивает две трети пациентов СИС, так как примерно 20% препаратов, предписанных в ОИТ считаются нефротоксическими8,9, это включает в себя нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), антибиотики, такие как ванкомицин и аминогликозиды, и химиотерапевтические агенты, такие как метотрексати цисплатин 7. Цисплатин является одним из самых мощных и распространенных химиотерапевтических препаратов, используемых в лечении твердых опухолей, таких как голова и шея, яичко, яичников имочевого пузыря 10. В почках цисплатин усвояется в проксимальной запутанной трубке (РСТ) через органический катиоический транспортер 2 (OCT-2) и в высоких концентрациях связывается с ДНК, вызываяпути смерти клеток 7,10,11,12. Накопление этого препарата в почках способствует нефротоксичности при смерти и воспалении13. Этот вредный побочный эффект оказывает огромное влияние на жизнь и прогноз одной трети больных раком, проходящих лечение цисплатина, поэтому крайне важно исследование новых методов лечения, которые могут снизить нефротоксичность, не теряя эффект убийства на раковыеклетки 10.

Из-за этого нефротоксического эффекта, цисплатин обычно используется в качестве индуктора АКИ в экспериментальных животных моделях, как описано вперед. У грызунов, первая модель AKI индуцированных цисплатин был зарегистрирован в 197114, но в настоящее время, многие различные протоколы появились с использованием дозы зависимых и кумулятивных эффектов цисплатина15. Таким образом, в зависимости от дозировки и количества применений, различные оценки тяжести травмы почекмогут быть вызваны 16,17,18,19,20,21. Наиболее частый метод состоит из внутриперитонеальной (i.p.) инъекции одной дозы цисплатина с последующим эвтаназией в последующие дни. В этом классическом протоколе, одна высокая нефротоксическая доза цисплатина (10-13 мг/кг у мышей и/или 3-8 мг/кг у крыс) вызывает серьезные гистологические изменения, такие как потеря границы кисти и клеточного мусора внутри трубчатого люмена, через несколько дней после инъекции цисплатина. Тяжесть гистологических изменений зависит от дозы, и признаки регенерации наблюдаются через 7 дней после инъекциицисплатина 16,17.

Хотя модели грызунов хорошо известны, мы решили воспользоваться характеристиками другого позвоночных, сосредоточив наши исследования на зебре(Danio rerio). Эта рыба широко используется для моделирования заболеваний человека, из-за его небольшого размера, внешнего оплодотворения, высоких темпов размножения, быстрого развития, прозрачности эмбрионов и личинок, низкой стоимости обслуживания, аналогичной анатомии млекопитающим (за некоторыми исключениями), высокой способности регенерации тканей, социального поведения, 70% генетического сходства с людьми и 84% счеловеческими заболеваниями, связанными с генами 22. Streisinger и др.23,24,25 начали исследования с зебры, которые подтвердили возможность использования этой модели организма для генетического анализа развития позвоночных. В исследованиях почек, зебрафиш появился не только в исследованиях развития, но и в качестве генетического инструмента в поисках новых генов, связанных с заболеваниями почек26. Кроме того, способность регенерации без образования рубцов и способность генерировать нефронов на протяжении всей их жизни, называется неонэфронез, сделать зебрафиш ключевой моделью животныхдля регенерации исследований 27,28. Кроме того, наличие экспериментальных моделей для различных заболеваний почек, в том числе острой и хронической травмы почек, демонстрируют универсальностьэтого экспериментального организма 26,29. Как и у млекопитающих, почечные прародители зебры являются производными от промежуточного мезодерма. Такие почечные прародители генерировать pronephros, которые позже будут развиваться в мезонофрос, который будет поддерживаться в качестве зрелого органа досовершеннолетия 29,30.

Взрослая почка зебры расположена на спинной стенке тела, между плавательным пузырем и позвоночником29. С вентрального вида зебра может быть сегментирована на триобласти (рисунок 1A):голова (H), ствол (Tr) и хвост (Ta)29. Так же, как млекопитающие, зебрафиш имеет нефроны, как функциональные единицы почек, которые делятся на трубоубийные сегменты (Рисунок 1A): почечная клетка (RC), проксимальные запутанные трубочку (PCT), проксимальные прямые трубочку (PST), дистальный рано (DE), поздний дисталь (DL) и сбор протока (CD)29. Зебрафиш разделяет генетическое сохранение и структурное сходство с человеческими нефронами(рисунок 1B),но не хватает некоторых конформаций, таких как промежуточные трубошки, также известный как петля Henle (LH)29,31. Пресноводные рыбы, как зебрафиш, как правило, окружены среды с очень низкой осмолярности, из-за этого, они, как правило, гиперосмотические и зависят от жабры, кожи на ранних стадиях, и почки для регулирования осмолярности ивыделения воды 32. Фильтрация крови из спинной аорты pronephros начинается около 48 ч после оплодотворения (hpf)33,34. Почка зебры является не только метаболическим органом выделения отходов, но и работает как гематопоэтический орган от 4 дней после оплодотворения (dpf) до взрослой жизни и эквивалентна костному мозгу у млекопитающих35. Во время развития гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) будут сеять почки, саморемонтироваться и генерировать миелоидные, эритроидные и лимфоидные клеточные линии, поддерживая транскрипционные факторы, сигнализируя молекулы, и высоко сохраненные генетические программыс млекопитающими 36,37. Исследования показали, что большинство эритроидов, тромбоцитов, миелоидных и лимфоидных клеток иммунной системы человекаприсутствуют в зебрафиш 37,38. Уникальные характеристики этого животного и сохраненные особенности человеческой почки сделали этот модель организма выгодным в исследовании функции почек, травм и регенерации.

Хотя почка зебры хорошо изучена и некоторые модели АКИ уже доступны в личинках и взрослой зебре28,на момент создания этого протокола не было никаких доказательств химически индуцированной небиотической модели АКИ у взрослых зебр. Кроме того, наша лаборатория фокусируется на тестировании пробиотических бактерий и микробиот полученных соединений для изучения регенерации и повреждения почек, таким образом, мы сосредоточили наши усилия на создании новой модели АКИ, вызванной цисплатином, у взрослых рыб. Видеосюжка, представленная в этой рукописи, демонстрирует процедуры новой модели индукции АКИ с использованием инъекции i.p. 120 ug cisplatin на г животного (120 мкг/г)(рисунок 2A). Эта доза была первоначально основана на исследованиях АКИ, вызванных цисплатином в моделях мурина, которые пошли вокруг 10 мг/кг (эквивалент 10 мкг/г)14,15,16,17, однако, эта доза не была достаточной, чтобы вызвать повреждение почек, связанные с нефротоксичности (данные не показаны). Таким образом, мы увеличили дозу до тех, которые используются в этом исследовании(рисунок 2B). Наша работа выявила дозозависимый эффект цисплатина в выживаемости после инъекции с индукцией повреждения тканей почек 24 л.с., о чем свидетельствует потеря трубчатой структуры, увеличение воспалительного проникновения и высокий уровень клеточной смертности. Здесь мы описываем два метода анализа развития АКИ, вызванного цисплатином: цитометрия потока, анализ инфильтрации клеток и TUNEL для измерения смертности клеток. Цитометрия потока является технологией, которая измеряет физические (размер и гранулированность) и химические (флуоресцентные соединения) характеристики клеток. Внутри цитометра клеточная подвеска проходит через оболочку жидкости, которая организует клетки в одной линии, что позволяет им пройти через лазерный луч одной клетки за один раз(рисунок 3A). Детектор перед световым лучом будет измерять передний рассеяние (FSC), который коррелирует с размером ячейки, а детекторы в сторону будут измерять боковой рассеяние (SSC), который коррелирует с гранулированностью клеток. Другие детекторы будут измерять флуоресценцию от частиц, флуоресцентных белков, или антител помеченныхклеток 39,40. Поскольку коммерческих антител для зебры в настоящее время не хватает, использование животных репортеров и флуоресцентных биомаркеров позволяет улучшить этот анализ и определить различныепопуляции клеток 41,42,43. Другим инструментом, используемым в этом протоколе, был анализ деоксинукотидидил-трансакшна терминала (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL). Анализ TUNEL является поздней стадией метода обнаружения апоптоза, который опирается на способность TdT идентифицировать фрагментированную ДНК и маркировать ее дезоксинуклеотидами, помеченными флуоресцентным маркером, который позже можно визуализировать и количественно оценитьс помощью микроскопии 44 (Рисунок 3B). Учитывая, что одной из наиболее ярких особенностей АКИ является индукция апоптоза в трубчатыхклетках почек 3, этотметод чрезвычайно выгоден, так как его можно анализировать с помощью цитометрии потока и/или микроскопии.

Подходы, представленные в этой статье, позволяют засовыкать статус АКИ и предлагают новую острую модель для изучения расстройств АКИ, которые могут быть полезны для исследования новых терапевтических целей в АКИ, связанных с цисплатином.

Protocol

Процедуры, описанные в этом протоколе, были ранее утверждены для использования в модели зебры Комитетом по этике использования животных Института биомедицинских наук Университета Сан-Паулу. 1. Индукция АКИ Сисплатин интраперитонеальной инъекцией Подготовка цисплатина рабочего решения путем разбавления запасного раствора до 850 мкг/мл в 0,9% NaCl. Держите при комнатной температуре, защищенной от света.ВНИМАНИЕ: Ткань рекомендует манипуляции цисплатин с персональным защитным оборудованием (PPE), включая очки, перчатки и лабораторное пальто. Храните раствор при комнатной температуре, защищенный от света. Подготовка 150 мг/л MS-222 (Tricaine) анестезии в системе воды45. Анестезировать взрослого зебру (5-9 месяцев) путем погружения примерно 1-2 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективно анестезированы рыбы должны быть безответственными на ощупь. Чтобы проверить эффективную анестезию, осторожно нажмите хвостовой плавник, чтобы наблюдать реакцию.ВНИМАНИЕ: Tricaine является раздражителем для кожи и глаз, использовать СИЗ манипулировать. С помощью пластиковой ложки передачи рыбы на абсорбянт поверхности, такие как бумажные полотенца, чтобы удалить избыток воды по всему телу. Затем, с пластиковой ложкой передачи рыбы в чашку Петри по шкале и взвесить рыбу. Примите к сведению вес рыбы, как это будет необходимо для расчета дозы.ПРИМЕЧАНИЕ: Поглощение избыточной воды из рыбы предотвращает завышение веса животного, не слишком сухой, так как наносит ущерб рыбе. Для достижения окончательной дозы в 120 мкг/г веса разделите йг конечной дозы (120 мкг) на мкг рабочего раствора цисплатина (850 мкг) и преобразуйтесь в микролитеры (ОЛ), размножаясь на 1000, чтобы получить объем 120 мкг цисплатина (141,2 мл). Затем умножьте это число (141,2 йл) на вес рыбы (г), чтобы получить окончательный объем, который будет введен. С пластиковой ложкой, передача рыбы на мокрой губкой с небольшим разрезом, чтобы держать его, с брюшной стороны вверх. Губка должна быть влажной с анестезией в системной воде. Заполните 31 G 1,0 мл инсулина шприц с расчетным объемом цисплатина рабочий раствор. Вставьте иглу в внутриперитонеалистической части животного вблизи тазового плавника, под мелким углом, чтобы избежать прокола внутренности (рисунок 2A). Затем медленно введать раствор. После инъекции поместите рыбу в бак, чтобы оправиться от анестезии. Следите за рыбой на наличие признаковнормального восстановления (например, плавательные движения, оперкулярные движения).ПРИМЕЧАНИЕ: животное должно восстановиться в ближайшие 3-5 минут. При необходимости, стимулировать рыбу, перемещая его с пластиковой ложкой, Пастер пластиковые пипетки, или положить его близко к шлангу с пузырьками. Для контроля рыбы, выполнить ту же процедуру путем введения раствора 0,9% NaCl. Используйте тот же расчет, следующий за долей массы тела: объем, который будет введен, будет 141 йл, умноженный на вес рыбы (g). Мониторинг выживания рыбы по крайней мере два раза в день в последующие дни(рисунок 2B). 2. Изоляция почек и обработка тканей для цитометрии потока иммунных клеток Для этой процедуры используйте иммунные клетки флуоресцентные отмеченныетрансгенныеживотные(например, Tg (mpo:GFP)). После 24 л.с. 120 мкг/г цисплатина, усыпляйте животных гипотермальным шоком (быстрым охлаждением).ПРИМЕЧАНИЕ: Гипотермальный шок был продемонстрирован, чтобы быть более эффективным, как метод эвтаназии, чем передозировка MS-222. Гипотермальный шок менее напряженный, быстрый, последовательный и безопасный для персонала, чем использование МС-222,ранее описанных 46,47. Во внешнем перемоке подготовьем ледяную воду в соотношении льда 5:1 к системной воде, поставь внутренний резервуар с экраном над льдом, подождите, пока вода достигнет 2-4 градусов по Цельсию.ПРИМЕЧАНИЕ: Рыбы не должны быть в непосредственном контакте со льдом, потому что это может вызвать термические ожоги и боль. Перенесите животное в ледяную воду, подождите не менее 10 минут, пока не будет потери ориентации и не будет оперкулярного движения. С пластиковой ложкой, поместите рыбу на бумажные полотенца, чтобы высушить избыток воды. Перенесите рыбу на 3% агоросовую пластину вскрытия и возьмите ее под стереоскоп с верхним светом. Ножницами обезглавите рыбу, быстро разрезая глаза, и удалите голову. С помощью тонких ножниц сделать разрез с открытой стороны на клоаку и удалить внутренние органы с тонкой типсов. Используйте булавки насекомых, чтобы ущипнуть стороны стенок тела, чтобы открыть тушу и подвергать почки, прикрепленной к позвоночнику. Отсоедините почку с тонкой типсов и поместите орган в 6 хорошо пластины с холодным раствором 1x PBS/2% FBS. Держись на льду. Возьмите ткани с пастер пластиковой пипетки и передать ткани через 40 мкм клетки ситечко над 50 мл трубки, мягко macerating его шприц поршень. Вымойте дважды с 1 мл 1x PBS/2% FBS и собирать клетки в 50 мл трубки. Клетки центрифуги при 400 × в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Аккуратно подберите весь супернатант с микропайпетом 1 мл и отбросьте его. Добавьте 500 МКЛ холодного 1x PBS, чтобы повторно использовать клетки и поместить их в 5 мл потока цитометрии труб. Держись на льду. Подсчитайте клетки в камере Нойбауэра, делая разбавление 1:10 в Trypan Blue(например, возьмите 10 МКЛ образца и смешайте с 90 йл Трипан Блю). Добавьте 10 йл смеси в камеру Нойбауэра и подсчитайте клетки под микроскопом.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные результаты ожидаются с 1-5 х 106 ячеек / мл и >80% жизнеспособности.ВНИМАНИЕ: Трипан синий канцерогенный агент, использовать PPE для обработки. Возьмите клетки для чтения с помощью цитометра. Затем проанализируйте результаты выбора населения, представляющих интерес. 3. Обработка взрослых Зебрафиш почки ткани для АНАЛИЗА TUNEL Для этой процедуры используйте животных дикого типа(например,АБ, Тюбинген и т.д.) или трансгенное животное с другим флуоресцентным цветом, чем комплект TUNEL, так как подобная флуоресценция может помешать анализу TUNEL. После 24 л.с. 120 мкг/г цисплатина, усыпляйте животных гипотермальным шоком (быстрым охлаждением). Смотрите 2.3-2.4. Рассекать рыбу, как описано в 2,5-2,6; почка должна оставаться прикрепленной к позвоночнику во время процедуры фиксации (объясняется ниже). Используя булавки насекомых, ущипнуть стороны стенок тела, чтобы открыть тушу и приколоть его на поверхности пробки, чтобы сохранить почки подвергаются.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура гарантирует, что почка остается в правильном положении для более длительного анализа. Затем поместите поверхность пробки с почкой лицом вниз в 6 хорошо пластины над свежеприготовленным раствором 4% параформальдегида (PFA). Держите его на ночь при 4 градусов по Цельсию.ВНИМАНИЕ: PFA является канцерогенным и раздражающим для кожи и слизистой поверхности. Подготовье решений PFA под химическим капотом с использованием СИЗ, включая оборудование для защиты глаз. На следующий день, вскрыть почки, как в 2,8. Поместите почки в 60 мм чашку Петри с 1x PBS и промыть дважды в 1x PBS. Подготовка 2% агарозы для создания матрицы поддержки для ткани. Отбросьте все оставшиеся 1x PBS из чашки Петри и налейте 2% агарозы медленно, чтобы покрыть весь орган. Затем расположите почку с помощью тонких типсов под стереомикроскопом, чтобы предотвратить складку почки. Пусть агароз затвердеет при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура будет держать ориентацию и форму органа через гистологическую обработку, так как лист, как форма органа вызывает тенденцию к раз, если он не находится внутри поддерживающей матрицы. После затвердевания агарозы используйте скальпель, чтобы разрезать агарозу вокруг ткани, образуя мелкие кубики, и удалить избыток агарозы вокруг ткани. Поместите кубики агарозы в кассету, подходящую для гистологической обработки.ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги можно сделать вручную или в автоматическом процессоре ткани. Во-первых, обработать ткани в кассете следующие шаги в течение 45 мин каждый при комнатной температуре: одна ванна 50% этанола, одна ванна 70% этанола, две последовательные ванны 95% этанола, и три последовательных ванны 100% этанола. После этого обработать ткань в двух последовательных ваннах ксилена и трех последовательных ваннах парафина; последний длится 1 час каждый при 60 градусах Цельсия.ВНИМАНИЕ: Внести изменения под химическим капотом, пары этанола и ксилена являются раздражающими и токсичными. Для приготовления парафиновых блоков растопите парафиновую чечевицу до 60 градусов по Цельсию. Откройте пластиковую кассету с тканью внутри и держите ее на теплой тарелке. Разогрева металлические формы для парафина. С пинцетом поместите ткань над металлической формой так, чтобы длина почки была параллельно основанию плесени. Добавить парафин, перераспределить ткани, если это необходимо. Обложка формы с основанием кассеты и добавить парафин, пока сетка покрыта. Пусть затвердеет при комнатной температуре, а затем место при -20 градусов по Цельсию для более быстрого процесса затвердевания. Отпустите парафиновый блок из металлической формы примерно через 20-30 минут. С микротомом, раздел ткани встроенные в парафин до 5 мкм толщиной. Используйте иланомизированные или положительно заряженные стеклянные слайды для сбора ткани. 4. Анализ TUNEL ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем протоколе используется комплект обнаружения смерти на месте (Таблица материалов). Dewax ткани слайды размещения их в двух последовательных ванн ксилена в течение 5 мин. Затем регидратировать ткани через градуированную серию этанола: 100%-95%-70%-50%, по 5 мин каждый. Поместите слайды в проточной холодной водопроводной воде, чтобы смыть этанол. Храните горки в дистиллированной воде. Подготовь темную инкубаторную камеру. Добавить мокрые бумажные полотенца на дне, чтобы сохранить влагу во время инкубации шаги.ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии инкубационой камеры можно использовать чашку Петри с влажной бумагой в нижней и две зубочистки для места слайда. Приготовьте свежий рабочий раствор Proteinase K:10 мкг/мл в 10 мМ Трис/HCl, рН 7,4-8.ПРИМЕЧАНИЕ: Proteinase K используется в качестве агента протеабилизации, как это рекомендовано тканевым. Поместите слайды в темную камеру инкубатора и добавьте рабочий раствор Proteinase K до тех пор, пока не будут покрывать образцы. Инкубация в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия. В то время как образцы инкубируются, подготовьтесмесь реакции TUNEL: Добавьте 50 МКЛ ферментного раствора в 450 йл Label Solution. Защитите от света.ПРИМЕЧАНИЕ: Объем, который будет подготовлен, может быть скорректирован в той же пропорции 1:10. Объем рассчитывается в размере 50 мкл смеси для каждого раздела; это может меняться в зависимости от размера образцов. Возьмите темную камеру и мыть горки дважды с 1x PBS. Затем высушите область вокруг образца с помощью абсорбющей бумаги и добавьте 50 МКЛ смеси реакции TUNEL над каждым слайдом ткани, распределив раствор так, чтобы весь образец был покрыт. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию в течение 2 ч. Защитите от света. После инкубации, промыть слайд три раза с 1x PBS и высушить область вокруг образца с помощью бумажных полотенец. Добавьте 50 МКЛ DAPI 1:1000 к образцам, для ядерных счетчиков, и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре. Защитите от света. Промыть снова три раза с 1x PBS и высушить область вокруг образца. Намонтировать горку с анти-увядание гидрофильной среды, место coverslip, и печать с лаком для ногтей. Храните слайды горизонтально, защищенные от света при 4 градусах Цельсия.ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-увядающие свойства монтажной среды должны сохранять флуоресценцию образцов, но можно использовать любую гидрофильные среды доступны. Окончательный шаг уплотнения с лаком для ногтей имеет решающее значение, чтобы избежать обезвоживания. Визуализууууть образцы под флуоресцентный микроскоп. Для этого типа флуоресцентного пигмента используйте возбуждение длины волны в диапазоне 520-560 нм (зеленый) и обнаружение в диапазоне 570-620 нм (красный).

Representative Results

Почка зебры является плоским пигментным органом, расположенным на спинной стенке, а его основной функциональный блок, нефрон, сохраняется с млекопитающими(рисунок 1). Особенность наличия только одной почки с высокой способностью регенерации делает этот модель организма отличным выбором для моделирования травмы почек. Протоколы, представленные в этой работе, предназначены для индуцирования АКИ путем внутриперитонеальной (т.е.) инъекции цисплатина у взрослыхзебры (рисунок 2),а затем анализируются двумя методами, описанными ранее:цитометрия потока (рисунок 3A) и TUNEL(рисунок 3B). На рисунке 4 изображена куча всего процесса. Дозы цисплатина были применены на основе первоначально описанныхв мышиных моделях 15,16,17, в которых стандарт используется 10-13 мг цисплатина на кг животного (мг/кг). Тем не менее, зебрафиш показал, что более устойчивы к цисплатину, чем мышь (данные не показаны), и окончательная доза была увеличена. Когда мы оценивали выживаемость животных, эксперименты показали дозозависимый эффект цисплатина(рисунок 5A). Из-за этого, мы рекомендуем следовать инструкциям точно так, как это объясняется в этом протоколе и контролировать выживаемость животных постоянно в качестве меры воспроизводимости, прежде чем собирать какой-либо материал. После инъекции 120 мкг/г цисплатина(рисунок 5A, красная линия),снижение выживаемости около 30% животных наблюдалось в первые 24 ч и выживание постепенно снижалось до достижения около 20% живых животных на 5-й день после инъекции, затемстабилизировалось (рисунок 5A). Токсичность цисплатина не была затронута полом животных, так как самцы и самки имеют схожие кривые выживаемости(рисунок 5B). Анализ кинетики ЦИСплатин-индуцированной АКИ показал повышенное воспаление и гибель клеток в почках 24 л.с. Одним из самых быстрых и количественных способов оценки воспаления является цитометрия потока, но, учитывая отсутствие антител против антигенов зебры, доступных на коммерческой основе для этого метода, необходимо использовать трансгенную линию с иммунным маркером. В настоящее время, многие зебры линий маркировки иммунных клеток доступны(таблица 1). Эти строки можно использовать отдельно или в комбинации, учитываядостаточно репертуара для анализа 48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60. Это значительно упрощает технику, так как не нужен ни один шаг инкубации антител, наоборот, после изоляции клеток механическим разделением, возможно прямое считывания на цитометре. Как упоминалось ранее, почка зебры является не только органом фильтрации крови с гомеостатической функцией, но и анатомическим местом гематопоеза у взрослых, эквивалентным костному мозгуу млекопитающих 33,34,35. Таким образом, при анализе его цитометрии потока можно дифференцировать популяцииклеток, сопоставимые с человеческой кровью 61,62 (рисунок 6A),что позволяет нам идентифицировать популяции клеток изначально по размеру и детализации и исключить мусор. В этом случае мы использовали трансгенную линию под названием Tg (mpo:GFP)52, которая выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) вместе с ферментом миелопероксидазы, который присутствует в нейтрофилях. Зная это, наша стратегия ворот была основана на первоначальном разделении популяции гранулоцитов(рисунок 6B). После этого дублетные клетки были исключены, так как они могут значительно изменить анализ и привести к неточным выводам. Дублет — это одно событие, которое состоит из 2 независимых частиц и может быть исключено путем выбора высоты рассеяния вперед (FSC-H) против участка плотности вперед (FSC-A)(рисунок 6C). После этого шага были выявлены и отобраны клетки, которые выразили флуоресцентный маркер(рисунок 6D). Наконец, статистика населения была извлечена из анализа и построена в процентах от клеток(рисунок 6E). Одной из наиболее заметных характеристик цисплатина нефротоксичность трубчатойклеточной смерти 10, и легко визуализировать это мы использовали анализ TUNEL для обнаружения апоптоза. Этот метод рекомендует использовать клетки и ткани дикого типа, которые не имеют флуоресцентных маркеров, так как параллельная флуоресценция будет вмешиваться в анализ, в случае зебры рекомендуется использовать линии дикого типа, такие как AB, Тюбинген, TAB, или трансгенной линии с флуоресцентным белком, который не мешает цвету флуоресценции TUNEL. Техника TUNEL позволяет проводить анализ с помощью цитометрии потока или микроскопии. Микроскопия имеет то преимущество сохранения структуры тканей, что позволяет увидеть, какие клетки умирают. Под флуоресцентным микроскопом яркие ядра апоптотических клеток легко дифференцироваться от фона. У животных, вводимых сцисплатином (рисунок 7B),больше мертвых клеток,чем у контроля (рисунок 7A)при 24 л.с. Окончательная количественная оценка была сделана с вариантом счетчика клеток программного обеспечения FIJI и показал статистически больше мертвых клеток в цисплатин-обработанных почек, чем в элементах управления (Рисунок 7C) Протокол, описанный в этой рукописи, показал, как использовать цисплатин в качестве индуктора АКИ у взрослых зебр, который является доза-ответчиком, быстро и надежно. На основе данных, полученных в результате выживаемости и измерения признаков нефротоксичности цисплатина, включая воспаление (обнаруженное цитометрией потока) и гибель клеток (обнаруженные TUNEL assay), мы предлагаем эту модель для изучения нефротоксичности цисплатина, а также для будущих методов лечения заболеваний, связанных с АКИ. Рисунок 1: Структура и сравнение зебры и человеческих почек. А. (1) Боковой вид взрослой зебры с почкой, представленной в темно-коричневом цвете, расположенном в спинной стенке рыбы, между плавательным пузырем (sb) и позвоночником. (2) Вентальный вид почки, показывающей нефроны (желтые), соединенные со сбором протока (синий). Различные области почки помечены: голова (H), ствол (Tr), и хвост (Ta). (3) Схема представляющих зебры нефронов и их сегменты помечены и окрашены в матче генетических сохраненных регионов с человеком nephron. B. (1) Стрельцое представление о человеческой почке. (2) Схема, изображающая человеческого нефрона с помеченными и цветными сегментами. RC: почечная тельца; РСТ: проксимальная запутанная трубоубий; PST: проксимальные прямые трубоубивания; TL: тонкая конечность; LH: Петля Хенле; TAL: толстая восходящая конечность; DE: дистальный рано; DL: дистальный поздно; DCT: дистальные запутанные трубоубий; CD: сбор протока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Экспериментальный дизайн для цисплатин-индуцированной АКИ. А. Боковой и брюшной вид взрослой зебры, указывающей на положение иглы во время процедуры инъекции. Игла проникает под углом 20-30 градусов от живота и вставляется медленно параллельно брюшной стенке, избегая прокола внутренностей. Б. Экспериментальный дизайн цисплатин-индуцированной АКИ: (1) Инъекция цисплатина 120 мкг/г на животное в день ноль. (2) Перед попыткой шаг 3, мониторинг выживаемости рыб после инъекции рекомендуется с первого дня до десяти дня. (3) Рассечения почек на следующий день после инъекции цисплатина для дальнейшей обработки методов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Механизмы цитометрии потока и методы TUNEL. А. Обзор цитометра потока: суспензия клеток гидродинамически ориентирована на одну линию оболочкой жидкости, в результате чего клетки проходят один за другим перед лазерным лучом. Детекторы спереди и сбоку измеряют передний рассеяние (FSC), боковое рассеяние (SSC) и флуоресценцию клеток. Б. Принцип анализа TUNEL. Терминал деоксинуклеотидил трансферазы (TdT) опосредует добавление флуоресцентного dUTP к 3′-OH концам фрагментированной ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Flowchart представленных методов. А. Flowchart показывая шаги, чтобы следовать при выборе для анализа ткани почек через поток цитометрии (оранжевый) или TUNEL (синий), при индуцировании АКИ путем инъекции цисплатина (серый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Мониторинг выживаемости цисплатина инъекционных рыб. А. Выживаемость различных доз инъекций цисплатина (25 – 50 – 112,5 – 120 мкг/г). Тест Лог-ранга (Мантел-Кокс), p < 0.01. Б. Выживаемость мужчин по сравнению с женщинами, введенных с 120 мкг / г цисплатина. Тест Лог-ранга (Мантел-Кокс), p < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 6: Ворота стратегии для трансгенной линии зебры. А. Плотность участка зебры взрослых почек клетки, популяции разделены по размеру (FSC-A) и детализации (SSC-A). Различные популяции выбираются цветными овалами/кругами. Розовый: Эритроид; Черный: лимфоид; желтый: Предшественники; Красный: гранулоциты. Б. Плотность участка бокового рассеяния (SSC-A) и области рассеиваний (FSC-A) для отбора популяции гранулоцитов в почках. К. Плотность участка вперед рассеиваются высоко (FSC-H) и вперед рассеяния области (FSC-A) для выбора синглет населения внутри ворот гранулоцитов. Д. Плотность участка области рассеивать вперед (FSC-A) и FITC-A:MPO для выбора mpo:GFP положительных клеток (нейтрофилов) в почках. Положительная популяция считается около 103 на, флуоресценции интенсивности. Е. График процента mpo:GFP положительных клеток (нейтрофилов) в управлении против Цисплатин животных, 24 hpi . Неоплаченный т-тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 7: TUNEL анализ цисплатина инъекционных рыб. А. Микрофотографии фиксированной взрослой почки 24 ч после инъекции цисплатина 120 мкг/г. Элементы управления вводятся с 0,9% NaCl. Положительные клетки TUNEL (апоптотические клетки) окрашены в красный цвет (белые стрелки). DAPI (синий) используется в качестве ядерного противовеса. Шкала бар: 50 мкм. 20x увеличение. Б. График, показывающий количественную оценку количества мертвых клеток в почках в 20 раз поля. Неоплаченныйт-тест, р < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Трансгенная линия Тип ячейки помечены Ссылки Tg (spi1:EGFP)pA301 Миелоидные клетки Уорд и др. 200348 Tg (zpu1:GFP) Миелоидные клетки Хсу и др. 200449 Tg(mhc2dab:GFP)sd6 Моноцитов Уиттамер и др. 201150 Tg (lysC:DsRED2) Нейтрофилов Зал и др. 200751 Tg (mpo:GFP) Нейтрофилов Матиас и др. 200652 Tg(mpeg1:mCherry) Макрофаги Эллетт и др. 201153 Tg(mpeg1:Dendra2) Макрофаги Харви и др. 201354 Tg(lck:GFP) Т-клетки Лангенау и др. 200455 TgBAC(ikaros:EGFP) Т-клетки Баджогли и др. 200956 Tg (rag1:GFP) Т-клетки Джессин и др. 199957 Tg(rag2:GFP) Т-клетки Джессин и др. 200158 Tg (CD79:GFP) В-клетки Лю и др. 201759 Tg(CD45:DsRed) Лейкоцитов Бертран и др. 200860 Таблица 1: Трансгенные линии зебры для иммунных клеток. Таблица возобновления имена зебры репортер линий с соответствующим типом иммунных клеток помечены и справочные статьи, где они были построены. Сочетание этих линий зебры может предложить новые возможности выбора клеток по цитометрии потока.

Discussion

Распространенность заболеваний почек продолжает расти во всем мире, становясь глобальной проблемой общественного здравоохранения, которая затрагивает миллионылюдей 63. Поиск способа лечения почек раненых лиц имеет первостепенное значение, а также понять больше об их этиологии и прогрессии. Несколько исследований были с использованием моделей животных, чтобы понять повреждения почек. Зебрафиш почки (Рисунок 1) был изучен в течение многих лет в биологии развития и травмы исследований из-за его самовосхвестьюспособности и генетическое сходство 29,64. Здесь мы представляем новую модель AKI у взрослых зебр, используя свойства цисплатина в качестве нефротоксического агента, подробно описывая шаги для выполнения быстрой и острой реакции с повреждением видимых, как только 24 hpi (Рисунок 2). Более того, здесь мы объясним два метода, которые помогут дать оценку повреждению тканей после инъекции цисплатина, цитометрии потока и TUNEL(рисунок 3).

Текущие модели AKI у взрослых зебры включают в себя i.p. инъекции гентамицина, который вызывает значительные повреждения в нефрона и трубочки уничтожения, неонэфронез события начинаются с 5-го дня, и регенерация завершена на 21 дней послеинъекции 65. С другой стороны, модель сепсиса связанных острой травмы почек (S-AKI) была создана в результате инфекции с Edwardsiella tarda, так как значительно увеличилось выражение маркеров АКИ, таких как инсулиноподобный фактор роста связывания белка-7 (IGFBP7), ингибитор тканей металлопротеиназы 2 (TIMP-2), и молекулы травмы почек-1 (КИМ-1), у личиноки взрослых зебры. Зебрафиш известен как высокопрофильное животное для поиска терапевтических агентов, и это включает в себя использование пробиотиков и микробиоты полученных метаболитов для изучения функции почек ирегенерации 67. Однако имеющиеся модели могут непосредственно повлиять на результаты этих методов лечения. Таким образом, мы создали другой метод, чтобы вызвать АКИ у взрослых зебры (Рисунок 4), используя цисплатин как известный нефротоксический агент, который не будет иметь прямого известного воздействия на микробиоту рыбы, как и гентамицин модель за то, что антибиотик, или инфекции С. Tarda, за то, что сепсис модели. Однако, в то же время, что мы разрабатывали наш протокол цисплатина, другая группа также исследовала нефротоксические эффекты цисплатина у взрослых зебры, упрощая дозу до 10-20-30 мкг на животное68. Хотя они также показали, цисплатин доза зависит эффект в выживании, мы рекомендуем осторожность в использовании одного количества цисплатина для всех рыб, как зебрафиш с того же возраста может иметь очень разные размеры и вес, и это может вызвать измененияв результатах 69,70. Мы считаем важным приспособить дозу к соответствующему весу животного, как это делается у мышей и это исследование.

В наших экспериментах со взрослыми зебрами цисплатин проявлял эффект доза-ответ. Это было визуализировано путем мониторинга выживаемости животных после инъекции цисплатина(рисунок 5). Мы использовали выживаемость как способ оценки интенсивности дозы цисплатина, а не как меру нефротоксичности, так как никакой другой физический признак не виден во время мониторинга. Это может быть сопоставимо с грызунами, в которых тяжесть травмы почек может быть модулирована дозировкой и частотой инъекции цисплатина15,достигая смертельных доз с более высокими концентрациями цисплатина71. Мертвые также видели в последующие дни в личинок модели цисплатина72. Так как наша цель состояла в том, чтобы вызвать острую травму в течение нескольких дней, мы выбрали дозу 120 мкг/г цисплатина, как это возможно наблюдать повреждение почек 24 ч после инъекции, однако, это может быть скорректировано в зависимости от целей исследования.

У людей, AKI клинически диагностируется снижением скорости гломерулярной фильтрации (GFR), повышенный креатинин сыворотки, и азот мочевиныкрови 3. В зебрафиш, репертуар моделей AKI включает в себя некоторыегенетически-условные модели 73,74 и некоторые связанные снаркотиками модели 65,72, но, как некоторые из функциональных параметров AKI не могут быть измерены на зебрафиш из-за технических трудностей (например, сбор крови), большинство исследований принимает морфологические и визуальные методы для наблюдения за особенностями AKI1, 75, таких как наше исследование.

У грызунов цисплатин попадает в эпителиальные клетки проксимальных и дистальных труб, внутри клетки происходит метаболическая активация и становится высокореактивным, действующим на клеточные органеллы и вызывающим изменения в структуре клеток. Эти изменения могут вызвать апоптоз и аутофагию и даже некроз, в очень высоких дозах. В ответ на это повреждение, многие цитокины высвобождаются и лейкоциты набираются приводит к воспалению и влияет на функциональность органа15. Это подчеркивает важность оценки того, какой тип клеток можно найти в травмированной почке, как жители или проникли иммунных клеток. Здесь мы показали, как оценить это по цитометрии потока, используя трансгенные иммунные линии репортера доступны в настоящее время(таблица 1). Цисплатин увеличил процент нейтрофилов(mpo:GFP положительных клеток) в почках 24 ч после инъекции(рисунок 6). В случае зебры, почки нишу HSCs, которые дают возможность различных типов клеток крови. Тем не менее, многие гранулоциты и макрофаги обычно циркулируют в крови. В нашем примере мы использовали трансгенную линию mpo:GFP, которая выражает GFP под промоутером миелопероксидазы нейтрофилов52. Оригинальные исследования mpo:GFP трансгенной линии продемонстрировали выражение миелопероксидазы в различных состояниях нейтрофиловогосозревания 76, но наша стратегия ворот сосредоточена на фракции гранулоцитов, которая включает в себя зрелыеклетки, поступающие из крови 52, таким образом, наш анализ включает в себя проникли клетки, а не резидентных клеток. Это важно учитывать при изоляции желаемой популяции клеток.

Как поясняется выше, апоптоз является самым классическим маркером АКИ, связанного с цисплатином. Здесь мы продемонстрировали простой протокол локализации мертвых клеток с помощью анализа TUNEL. Инъекция цисплатина увеличила количество апоптотических клеток на 24 л.с.(рисунок 7). Это можно легко количественно, подсчитывая непосредственно мертвые клетки из ткани. Тем не менее, для идентификации клеточной смерти можно использовать использование антител против желаемой клетки(например, трубчатых клеток) или использование трансгенной линии репортера вместе с этой техникой. По сравнению с гентамицин-индуцированной модели АКИ, цисплатин, кажется, более тяжелая модель, так как апоптоз гентамицина был выше на третий день послеинъекции 65.

Несмотря на различные побочные эффекты, цисплатин по-прежнему широко используется в терапии рака, из-за его эффективности против различных видов рака, в том числе карциномы, опухоли зародышевых клеток, лимфомы, исаркомы 77. Нефротоксичность встречается у одной трети пациентов влечении цисплатином 10, таким образом, поиск стратегий, которые могут уменьшить этот эффект и увеличить ренопротекторию является обязательным. Мы считаем, что методы и методы, представленные в этой рукописи, помогут прояснить механизмы травмы почек и найти терапевтические цели, которые могут иметь важное значение для улучшения качества жизни людей, которые страдают от почечных осложнений, в основном связанных с использованием цисплатина.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Фондом Ампаро и Пескиса-де-Сан-Паулу – FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Конселью Национальный де Десенвольвименто Циентафико е Текнолигико (CNPq) и Корденаньо де Аперфьяцомменто де Пессоаль де Невель Верхне (CAPES), финансовый код 001. Мы благодарим наших сотрудников в лаборатории Марии Риты душ Сантуш электронной Passos-Буэно и Зебрафиш фонда генетики и эволюционной биологии Департамента, в Институте бионауки Университета Сан-Паулу. Мы благодарим Кристиану Наффу де Соуза Бреду и Терезу Ракель де Оливейру Рамальо за комментарии и предложения по рукописи. Мы высоко ценим и благодарим Марсио Вильяра Мартинса из мультимедийной команды Института биомедицинских наук за запись, издание и производство этого видео.

Materials

1x PBS Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water
31 G 1.0 cc insulin syringe BD Plastipak 990256 Needle: BD Precision Glide 300110
3.5 L Fish tank Tecniplast Part of the aquactic system
6 well plate Corning 351146
10 mM Tris/HCl Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)
50 ml Falcon tube Corning 352070
2-3% Agarose Invitrogen 16500-500 Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.
2% FBS Gibco 12657-09 Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS
4% Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C
50% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
70% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
90% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
100% Ethanol Synth 00A1115.01.BJ
100% Xylene Synth 00X1001.11.BJ
Cell strainer 40 µm Corning 431750
Cisplatin Blau Farmacêutica 16020227 C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.
Cork board sheet Obtained from local stationary store
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Stock solution 20 mg/ml dissolved in water
Fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Flow cytometry tubes Corning 352052
Glass slide Thermo-Fisher 4445
Histology cassette Ciencor 2921
Immuno stain chamber Ciencor EP-51-05022
Incubator NAPCO 5400 Set to 37 °C
Insect pins Papillon Model micro15x20
In Situ Cell Death Detection Kit Roche Diagnostics 12156792910
Metal mold Leica Biosystems 3803081
Micropipette 200-1000 µL Eppendorf Use 1 mL tips
MS-222 (Tricaine) Fluka Analytical A5040-25G
NaCl 0.9% Synth C1060.01.AG Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water
Nail polish Prefer transparent
Neubauer chamber Precicolor HGB
Pasteur plastic pipet United Scientific Supplies P31201
Paraplast Sigma-Aldrich P3558
Petri dish J.ProLab 0307-1/6 60 and 100 mm
Plastic spoon Obtained from local store
Proteinase K New England BioLabs P8102 Diluite from stock 20 mg/ml
Scissors Fine Science Tools 14060-09
Scalpel blade Solidor
Sponge Obtained from local store
Trypan Blue Cromoline 10621/07
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10
Centrifuge Eppendorf 5810R
Cytometer BD Biosciences FACSCanto II
Fluorescence Stereoscope Zeiss Axio Zoom.V16
Fluorescence Microscope Zeiss AxioVert.A1
Microtome Leica Jung Supercut
Scale Ohaus Corporation AR2140
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish Renal Pathology: Emerging Models of Acute Kidney Injury. Current Pathobiology Reports. 3 (2), 171-181 (2015).
  2. Guo, C., Dong, G., Liang, X., Dong, Z. Epigenetic regulation in AKI and kidney repair: mechanisms and therapeutic implications. Nature Reviews Nephrology. 15 (4), 220-239 (2019).
  3. Makris, K., Spanou, L. Acute Kidney Injury: Definition, Pathophysiology and Clinical Phenotypes. Clinical Biochemist Reviews. 37 (2), 85-98 (2016).
  4. Sawhney, S., et al. Intermediate and Long-term Outcomes of Survivors of Acute Kidney Injury Episodes: A Large Population-Based Cohort Study. American Journal of Kidney Diseases. 69 (1), 18-28 (2017).
  5. Saxena, A., Meshram, S. V. Predictors of Mortality in Acute Kidney Injury Patients Admitted to Medicine Intensive Care Unit in a Rural Tertiary Care Hospital. Indian Journal of Critical Care Medicine. 22 (4), 231-237 (2018).
  6. Sawhney, S., Fraser, S. D. Epidemiology of AKI: Utilizing Large Databases to Determine the Burden of AKI. Advances in Chronic Kidney Disease. 24 (4), 194-204 (2017).
  7. Sales, G. T. M., Foresto, R. D. Drug-induced nephrotoxicity. Revista da Associação Médica Brasileira. 66, 82-90 (2020).
  8. Perazella, M. A. Drug use and nephrotoxicity in the intensive care unit. Kidney International. 81 (12), 1172-1178 (2012).
  9. Taber, S. S., Mueller, B. A. Drug-associated renal dysfunction. Critical Care Clinics. 22 (2), 357-374 (2006).
  10. Pabla, N., Dong, Z. Cisplatin nephrotoxicity: mechanisms and renoprotective strategies. Kidney International. 73 (9), 994-1007 (2008).
  11. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 307-320 (2005).
  12. Shirmanova, M. V., et al. Chemotherapy with cisplatin: insights into intracellular pH and metabolic landscape of cancer cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 8911 (2017).
  13. Xu, Y., et al. A Role for Tubular Necroptosis in Cisplatin-Induced AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (11), 2647-2658 (2015).
  14. Kociba, R. J., Sleight, S. D. Acute toxicologic and pathologic effects of cis-diamminedichloroplatinum (NSC-119875) in the male rat. Cancer Chemotherapy Reports. 55 (1), 1-8 (1971).
  15. Perše, M., Večerić-Haler, &. #. 3. 8. 1. ;. Cisplatin-Induced Rodent Model of Kidney Injury: Characteristics and Challenges. BioMed Research International. 2018, 1462802 (2018).
  16. Dobyan, D. C., Levi, J., Jacobs, C., Kosek, J., Weiner, M. W. Mechanism of cis-platinum nephrotoxicity: II. Morphologic observations. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 213 (3), 551-556 (1980).
  17. Singh, G. A possible cellular mechanism of cisplatin-induced nephrotoxicity. Toxicology. 58 (1), 71-80 (1989).
  18. Jodrell, D. I., et al. The renal effects of N10-propargyl-5,8-dideazafolic acid (CB3717) and a non-nephrotoxic analogue ICI D1694, in mice. British Journal of Cancer. 64 (5), 833-838 (1991).
  19. McKeage, M. J., et al. Lack of nephrotoxicity of oral ammine/amine platinum (IV) dicarboxylate complexes in rodents. British Journal of Cancer. 67 (5), 996-1000 (1993).
  20. Gautier, J. C., et al. Evaluation of novel biomarkers of nephrotoxicity in two strains of rat treated with Cisplatin. Toxicologic Pathology. 38 (6), 943-956 (2010).
  21. Vinken, P., et al. Tissue Kim-1 and urinary clusterin as early indicators of cisplatin-induced acute kidney injury in rats. Toxicologic Pathology. 40 (7), 1049-1062 (2012).
  22. Zorzetto, R., Guimarães, M. Um peixe modelo. Pesquisa FAPESP. 209, 16-21 (2013).
  23. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  24. Chakrabarti, S., Streisinger, G., Singer, F., Walker, C. Frequency of gamma-Ray Induced Specific Locus and Recessive Lethal Mutations in Mature Germ Cells of the Zebrafish, BRACHYDANIO RERIO. 유전학. 103 (1), 109-123 (1983).
  25. Walker, C., Streisinger, G. Induction of Mutations by gamma-Rays in Pregonial Germ Cells of Zebrafish Embryos. 유전학. 103 (1), 125-136 (1983).
  26. Morales, E. E., Wingert, R. A. Zebrafish as a Model of Kidney Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 60, 55-75 (2017).
  27. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney International. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  28. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Translational Research. 163 (2), 109-122 (2014).
  29. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods in Cell Biology. 100, 233-260 (2010).
  30. Saxén, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1 (3), 385-392 (1987).
  31. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
  32. Hill, A. J., Bello, S. M., Prasch, A. L., Peterson, R. E., Heideman, W. Water permeability and TCDD-induced edema in zebrafish early-life stages. Toxicological Sciences. 78 (1), 78-87 (2004).
  33. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
  34. Majumdar, A., Drummond, I. A. Podocyte differentiation in the absence of endothelial cells as revealed in the zebrafish avascular mutant, cloche. Developmental Genetics. 24 (3-4), 220-229 (1999).
  35. Song, H. D., et al. Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidney marrow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (46), 16240-16245 (2004).
  36. Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
  37. Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. The International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
  38. Palis, J., Yoder, M. C. Yolk-sac hematopoiesis: the first blood cells of mouse and man. Experimental Hematology. 29 (8), 927-936 (2001).
  39. O’Donnell, E. A., Ernst, D. N., Hingorani, R. Multiparameter flow cytometry: advances in high resolution analysis. Immune Network. 13 (2), 43-54 (2013).
  40. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
  41. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118 (2), 289-297 (2011).
  42. Kulkeaw, K., et al. Purification of zebrafish erythrocytes as a means of identifying a novel regulator of haematopoiesis. British Journal of Haematology. 180 (3), 420-431 (2018).
  43. Ratnayake, D., Currie, P. D. Fluorescence-Activated Cell Sorting of Larval Zebrafish Muscle Stem/Progenitor Cells Following Skeletal Muscle Injury. Methods in Molecular Biology. 1889, 245-254 (2019).
  44. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  45. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
  46. Wilson, J. M., Bunte, R. M., Carty, A. J. Evaluation of rapid cooling and tricaine methanesulfonate (MS222) as methods of euthanasia in zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (6), 785-789 (2009).
  47. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  48. Ward, A. C., et al. The zebrafish spi1 promoter drives myeloid-specific expression in stable transgenic fish. Blood. 102 (9), 3238-3240 (2003).
  49. Hsu, K., et al. The pu.1 promoter drives myeloid gene expression in zebrafish. Blood. 104 (5), 1291-1297 (2004).
  50. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  51. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  52. Mathias, J. R., et al. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1281-1288 (2006).
  53. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  54. Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate immune response to Streptococcus iniae infection in zebrafish larvae. Infection and Immunity. 81 (1), 110-121 (2013).
  55. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  56. Bajoghli, B., et al. Evolution of genetic networks underlying the emergence of thymopoiesis in vertebrates. Cell. 138 (1), 186-197 (2009).
  57. Jessen, J. R., Willett, C. E., Lin, S. Artificial chromosome transgenesis reveals long-distance negative regulation of rag1 in zebrafish. Nature Genetics. 23 (1), 15-16 (1999).
  58. Jessen, J. R., Jessen, T. N., Vogel, S. S., Lin, S. Concurrent expression of recombination activating genes 1 and 2 in zebrafish olfactory sensory neurons. Genesis. 29 (4), 156-162 (2001).
  59. Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
  60. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135 (10), 1853-1862 (2008).
  61. de Jong, J. L., Zon, L. I. Histocompatibility and hematopoietic transplantation in the zebrafish. Advances in Hematology. 2012, 282318 (2012).
  62. Ossowski, P., et al. Differentiation of morphotic elements in human blood using optical coherence tomography and a microfluidic setup. Optics Express. 23 (21), 27724-27738 (2015).
  63. McCullough, K., et al. Measuring the population burden of chronic kidney disease: a systematic literature review of the estimated prevalence of impaired kidney function. Nephrology Dialysis Transplantation. 27 (5), 1812-1821 (2012).
  64. Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  65. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of Cellular Dynamics during Zebrafish Adult Kidney Regeneration. Stem Cells International. 2015, 547636 (2015).
  66. Wen, X., et al. A zebrafish model of infection-associated acute kidney injury. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (2), 291-299 (2018).
  67. Gong, J., Noel, S., Pluznick, J. L., Hamad, A. R. A., Rabb, H. Gut Microbiota-Kidney Cross-Talk in Acute Kidney Injury. Seminars in Nephrology. 39 (1), 107-116 (2019).
  68. Kim, M. J., Moon, D., Jung, S., Lee, J., Kim, J. Cisplatin nephrotoxicity is induced via poly(ADP-ribose) polymerase activation in adult zebrafish and mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 318 (5), 843-854 (2020).
  69. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental Dynamics. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  70. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: a staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  71. Wagner, T., Kreft, B., Bohlmann, G., Schwieder, G. Effects of fosfomycin, mesna, and sodium thiosulfate on the toxicity and antitumor activity of cisplatin. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 114 (5), 497-501 (1988).
  72. Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (5), 923-929 (2005).
  73. Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (6), 1039-1047 (2012).
  74. Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney International. 83 (6), 1193-1200 (2013).
  75. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. Journal of Visualized Experiments. (96), e52540 (2015).
  76. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult zebrafish. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
  77. Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European Journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).

Tags

Acute Kidney InjuryCisplatinZebrafishNephrotoxicityInflammationCell DeathFlow CytometryTUNEL AssayChemotherapyRenal ProtectionRegeneration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Morales Fénero, C., Padovani, B. N., do Amaral, M. A., de Barros, G. J. B., de Oliveira, I. K. X., Hiyane, M. I., Camâra, N. O. S. Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e61575, doi:10.3791/61575 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image