マウス網膜色素上皮の光誘発電気応答を記録するための直接結合電解電解(DC-ERG)
Summary
ここでは、2000年代初頭にマルモラシュタイン、ピーチー、および同僚が最初に記述したDC-ERGとして知られている技術を用いて、マウスにおける網膜色素上皮(RPE)の光誘発電気応答を記録する方法を提示する。
Abstract
網膜色素上皮(RPE)は、網膜と絨毛キャピラリスの間に戦略的に位置する細胞の特殊な単層であり、光受容体の全体的な健康と構造的完全性を維持します。RPEは、極偏光され、アピカルに、そして基底位置の受容体またはチャネルを示し、水、イオン、代謝物、およびいくつかのサイトカインを分泌するベクター輸送を行う。
インビボでのRPE機能の非侵襲的な測定は、直接結合されたERG(DC-ERG)を使用して行うことができます。DC-ERGの背後にある方法論は、Marmorstein、Peachey、およびカスタマイズされた刺激記録システムを使用して、後に市販のシステムを使用して実証された研究グループによって開拓されました。DC-ERG技術は、ハンクの緩衝塩溶液(HBSS)で満たされたガラス毛細血管を使用して、感光体活性によるレリンタル空間の光誘発濃度変化から引き出されるRPEの遅い電気応答を測定する。長時間の光刺激とDC-ERG記録の長さは、それがドリフトやノイズに対して脆弱になり、使用できる録音の低収率をもたらします。ここでは、HBSSと電極ホルダーの外気に起因する気泡を減らす/除去するために真空圧を使用することにより、ノイズを低減しながら、記録の安定性を向上させる迅速で信頼性の高い方法を提示します。さらに、電源ラインのアーチファクトは、電圧レギュレータ/パワーコンディショナを使用して減衰されます。市販のERGシステムに必要な光刺激プロトコルと、C波、高速振動、光ピーク、オフレスポンスのDC-ERG成分の分析に必要な光刺激プロトコルが含まれています。記録の改善された容易さおよび急速な分析のワークフローのために、この簡易な議定書はRPE機能、疾患の進行、および薬理学的介入の評価の加齢に関連する変化を測定するのに特に有用である。
Introduction
網膜色素上皮(RPE)は眼の後部セグメントに並び、網膜恒常性1を維持するために重要な機能を発揮する特殊な細胞の単層である。RPEは、可視周期2と呼ばれるプロセスで光子捕捉視覚顔料を再生することによって、小屋外セグメント先端3の日経食類に参加することによって、光受容体と絨毛キャピラリ4,5との間の栄養素および代謝産物の輸送において光受容体を支持する。RPE機能の異常は、加齢黄斑変性症6、レーバーの先天性アマウロシス7、8およびベストビテッラ状黄斑ジストロフィー9のような多数のヒト網膜疾患の根下にある。ドナー眼組織は研究目的のためだけに得ることがしばしば困難であるので、遺伝子組み換えのある動物モデルは、10,11の疾患の発症を研究する別の方法を提供することができる。さらに、CRISPR cas9技術の出現と応用により、ゲノム導入(ノックイン)または欠失(ノックアウト)が、以前の遺伝子標的化技術12の限界を超える単純なワンステッププロセスで可能になりました。新しいマウスモデル13の可用性のブームは、非侵襲的にRPE機能を評価するために、より効率的な記録プロトコルを必要とする。
RPEの光誘発電気応答の測定は、直接結合された電気レティノグラム(DC-ERG)技術を用いて達成することができる。この感光体(a-wave)およびバイポーラ(b波)細胞応答を測定する従来のERG記録と組み合わせて使用すると、DC-ERGは、RPEの応答特性が、レチナル変性15、16、17、またはRPE機能障害が感光体喪失に先行するかどうかでどのように変化するかを定義することができる。このプロトコルは、最初にDC-ERG技術16、18、19、20を開発したMarmorstein、Peachey、および同僚の仕事から適応した方法を記述し、再現性と使いやすさを改善する。
DC-ERG記録は、ノイズの中断や導入がデータの解釈を複雑にする可能性がある、取得時間(9分)が長いため、実行が困難です。この新しい方法の利点は、ベースラインが短時間で定常状態に達し、動物が麻酔から早期に目覚め、毛細血管の気泡形成を起こしにくい可能性を減らすことです。
Protocol
このプロトコルは、国立眼科研究所の動物ケアおよび使用委員会によって承認された動物研究プロトコルで概説されている動物ケアガイドラインに従います。 1. DC-ERG用光刺激プロトコルのインポート 注: 以下の指示に従って、DC-ERG の光刺激プロトコルを ERG システム ソフトウェア (表) にインポートします。プロトコルは0.5分前刺激間隔?…
Representative Results
図2はmiR-204 ko/ko cre/+(条件付きKO)マウスと野生型(WT)マウスからのサンプルデータセットです。MiR-204 ko/ko cre/+は、網膜色素上皮におけるマイクロRNA204の条件付きノックアウトを有するマウスである。これらのマウスは、VMD2-CREマウス23を用いてフロックスmiR-204マウス(NEIGEFによって産生される)22を交流することによって生成される。MiR-204?…
Discussion
重要なステップ
良好なDC-ERG記録は、アウトガスや温度変化に非常に敏感であるため、アーティファクトや不要なドリフトを作成する気泡から自由である安定した電極を必要とします。マウスの記録を進める前に、HBSSバス溶液に電極を配置する際に安定したベースラインを達成することが不可欠です。小さな気泡は、キャピラリー電極の基部またはシリコン?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はNEIの壁内資金によって支えられた。著者らは、シェルドン・ミラー博士の科学的指導、技術的助言、RPE生理学と疾患の専門知識について心から認めている。著者らは、マウスコロニーを管理してくれたメーガン・コペラと動物ケアスタッフ、タルン・バンサル博士、レイモンド・ジョウ博士、元王博士に技術支援を求めた。
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
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Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).