Ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) para la detección específica y rápida del virus del lago Tilapia

La enfermedad por el virus del lago Tilapia (TiLVD) es una enfermedad viral en la tilapia (Oreochromis spp.) que al parecer causa muertes por tilapia en muchas regiones del mundo, incluyendo Asia^1,2, Africa, y América. La enfermedad fue reconocida por primera vez durante la mortalidad masiva de tilapia en 2009 en Israel, donde el número de tilapia silvestre en el lago Kinneret se desplomó dramáticamente de 257 a 8 toneladas por año^2. La enfermedad es causada por el virus del lago tilapia (TiLV), que ha sido asignado a la familia Amnoonviridae como un nuevo género Tilapinevirus y una nueva especie Tilapia tilapinevirus³. La caracterización genética de TiLV mostró que el virus es un virus de ARN envuelto, de sentido negativo y de una sola cadena que tiene 10 segmentos que codifican 10 proteínas^1,2,4. Varias especies de tilapia en el género Sarotherodon, Oreochromis,y Tilapine y otros peces de agua caliente (por ejemplo, gourami gigante (Osphronemus goramy)) han demostrado ser susceptibles a TiLV^2,5. Actualmente, este virus continúa propagó globalmente, posiblemente a través del movimiento de peces vivos infectados^6,7, mientras que el riesgo de transmisión viral a través de tilapia congelada o su producto es limitado⁸. La mortalidad sustancial debida a la infección por TiLV tiene el potencial de tener un impacto económico significativamente perjudicial en la industria de la tilapia. Por ejemplo, el impacto económico del síndrome de mortalidad de verano en Egipto asociado con la infección por TiLV se calculó en US$100 millones⁹. En consecuencia, es importante desarrollar un método de diagnóstico rápido y adecuado para facilitar el control de esta enfermedad en las piscifactorías.

Hasta ahora, el diagnóstico de TiLVD se ha basado en ensayos moleculares, aislamiento viral e histopatología. Se han desarrollado diferentes protocolos e imprimaciones pcR para el diagnóstico TiLV^10,,11. Por ejemplo, se ha desarrollado y validado un método de PCR cuantitativo de transcripción inversa basado en verde SYBR (RT-qPCR) con la sensibilidad de detectar tan solo dos copias/L del virus para la detección^{tiLV 10}. Otros métodos de PCR para la detección de TiLV incluyen TaqMan cuantitativo^{PCR 11}, RT-PCR², RT-PCR¹²anidado y RT-PCR¹³semianidado. Sin embargo, estos métodos requieren equipos de laboratorio sofisticados y períodos de tiempo relativamente prolongados para producir resultados debido a la complejidad de las reacciones, lo que los hace inadecuados para la aplicación en campo.

El ensayo de amplificación isotérmica (LAMP) mediado por bucle es una aplicación for-field rápida, sencilla y práctica^14,15. La técnica emplea el principio de una reacción de desplazamiento de la hebra, mientras que la reacción de amplificación se ejecuta en condiciones isotérmicas sin un sofisticado y costoso ciclor térmico^14,,15. En consecuencia, los productos LAMP amplificados o RT-LAMP se analizan en bandas tipo escalera utilizando electroforesis de gel de agarosa con una mancha fluorescente para la visualización segura del ADN o del ARN¹⁴ u observación a simple vista para la presencia de turbidez o un precipitado blanco^16,,17,,18. Por estas razones, esta técnica se ha utilizado para la detección in situ de diferentes patógenos de peces^{17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,27}. El propósito de este estudio fue establecer un ensayo RT-LAMP rápido, sensible y preciso para la detección de TiLV. El ensayo RT-LAMP ofrece cribado para TiLV en muestras de peces en un plazo de 30 minutos. La técnica se puede aplicar para el diagnóstico y la vigilancia de TiLVD.