Reverse Transcription Loop-Bemiddelde Isothermale Versterking (RT-LAMP) Assay voor de specifieke en snelle detectie van Tilapia Lake Virus

Tilapia lake virus disease (TiLVD) is een virale ziekte in tilapia(Oreochromis spp.) die naar verluidt tilapia sterfgevallen veroorzaakt in veel regio’s van de wereld, waaronder Azië^1,,2, Afrika en Amerika. De ziekte werd voor het eerst erkend tijdens de massale sterfte van tilapia in 2009 in Israël, waar het aantal wilde tilapia in het Kinneretmeer drastisch kelderde van 257 tot 8 ton per jaar². De ziekte wordt veroorzaakt door het tilapiameervirus (TiLV), dat aan de familie Amnoonviridae is toegewezen als een nieuw geslacht Tilapinevirus en een nieuwe soort Tilapia tilapinevirus³. Genetische karakterisering van TiLV toonde aan dat het virus is een nieuwe omhuld, negatief-zin, single-stranded RNA virus dat 10 segmenten codering 10 eiwitten^1,2,4. Verschillende soorten tilapia in het geslacht Sarotherodon, Oreochromis, en Tilapine en andere warmwatervissen (bijvoorbeeld reuzengourami (Osphronemus goramie))zijn vatbaar gebleken voor TiLV^2,5. Momenteel blijft dit virus zich wereldwijd verspreiden, mogelijk door de beweging van besmette levende vissen^6,7, terwijl het risico van virale overdracht via bevroren tilapia of het product ervan beperkt is⁸. Aanzienlijke sterfte als gevolg van TiLV-infectie heeft het potentieel om een aanzienlijk schadelijk economisch effect op de tilapia-industrie hebben. Bijvoorbeeld, de economische impact van de zomer sterfte syndroom in Egypte in verband met TiLV infectie werd berekend op US $ 100 miljoen⁹. Daarom is het belangrijk om een snelle en goede diagnostische methode te ontwikkelen om de bestrijding van deze ziekte in viskwekerijen te vergemakkelijken.

Tot nu toe was de diagnose van TiLVD gebaseerd op moleculaire testen, virale isolatie en histopathologie. Voor TiLV diagnose^10,11zijn verschillende PCR protocollen en primers ontwikkeld. Bijvoorbeeld, een SYBR groen-gebaseerde reverse transcription kwantitatieve PCR (RT-qPCR) methode met de gevoeligheid voor het detecteren van zo weinig als twee kopieën / μL van het virus is ontwikkeld en gevalideerd voor TiLV detectie¹⁰. Andere PCR-methoden voor TiLV-detectie zijn TaqMan quantitative PCR^11,RT-PCR^2,geneste RT-PCR¹²en semi-geneste RT-PCR¹³. Deze methoden vereisen echter geavanceerde laboratoriumapparatuur en relatief langere perioden om resultaten op te leveren vanwege de complexiteit van de reacties, waardoor ze ongeschikt zijn voor veldtoepassing.

De lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test is een snelle, eenvoudige en praktische for-field toepassing^14,15. De techniek maakt gebruik van het principe van een bundelverplaatsingsreactie, terwijl de versterkingsreactie onder isothermale omstandigheden loopt zonder een geavanceerde en dure thermische cycler^14,15. Bijgevolg worden versterkte LAMP-producten of RT-LAMP-producten geanalyseerd in ladderachtige banden met behulp van agarosegelelektroforese met een fluorescerende vlek voor ofwel de veilige visualisatie van DNA of RNA¹⁴ of observatie met het blote oog voor de aanwezigheid van troebelheid of een witte^{neerslaan16,17,18}. Om deze redenen is deze techniek gebruikt voor de detectie ter plaatse van verschillende vispathogenen^{17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}. Het doel van deze studie was om een snelle, gevoelige en nauwkeurige RT-LAMP test voor TiLV detectie vast te stellen. De RT-LAMP test biedt screening voor TiLV in vismonsters binnen 30 min. De techniek kan worden toegepast voor de diagnose en bewaking van TiLVD.