Summary

Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

Published: June 27, 2020
doi:

Summary

Dit artikel beschrijft protocollen voor het evalueren van de Tfh- en GC B-respons in het muismodel van influenzavirusinfectie.

Abstract

T Folliculaire Helper (Tfh) cellen zijn een onafhankelijke CD4+ T cel subset gespecialiseerd in het bieden van hulp voor germinaal centrum (GC) ontwikkeling en het genereren van high-affinity antilichamen. Bij influenzavirusinfectie worden robuuste Tfh- en GC B-celresponsen geïnduceerd om effectieve virusuitroeiing te vergemakkelijken, wat een gekwalificeerd muismodel voor Tfh-geassocieerde studie oplevert. In dit artikel beschreven we protocollen bij de detectie van basis Tfh-geassocieerde immuunrespons tijdens influenzavirusinfectie bij muizen. Deze protocollen omvatten: intranasale inenting van het influenzavirus; flowcytometriekleuring en analyse van polyklonale en antigeenspecifieke Tfh-cellen, GC B-cellen en plasmacellen; immunofluorescentiedetectie van GCs; enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) van influenzavirusspecifiek antilichaam in serum. Deze tests kwantificeren in feite de differentiatie en functie van Tfh-cellen bij influenzavirusinfectie, waardoor hulp wordt geboden voor studies naar het ophelderen van differentiatiemechanisme en manipulatiestrategie.

Introduction

In het afgelopen decennium zijn talrijke studies gericht op de nieuw geïdentificeerde CD4+ T-celsubset, Tfh-celsubset, voor zijn essentiële rollen in de ontwikkeling van het kiemcentrum (GC) B. B-cellymfoom 6 (Bcl6), dat voornamelijk wordt beschouwd als een genrepressor, is de afstammingsbepalende factor van Tfh-cellen voor het bewijs dat ectopische expressie van Bcl6 voldoende is om Tfh-differentiatie aan te drijven, terwijl een tekort aan Bcl6 resulteert in verdwenen Tfh-differentiatie1,2,3. In tegenstelling tot andere CD4+ T helper subsets die hun effectorfunctie uitvoeren door migratie naar de plaatsen van ontsteking, bieden Tfh-cellen de B-cel vooral hulp in de B-cel folliculaire zone van milt en lymfeklier. Co-stimulatory moleculen ICOS en CD40L, spelen een belangrijke rol in de interactie tussen Tfh en GC B cellen. Tijdens Tfh-differentiatie verzendt ICOS de nodige signalen van cognate B-cellen en fungeert het ook als een receptor die migratiesignalen ontvangt van omstander B-cellen voor B-celzonelokalisatie4,5. CD40L is een bemiddelaar van signalen van Tfh-cellen voor de proliferatie en overleving van B-cellen6. Een andere factor die dezelfde rol speelt als CD40L is de cytokine IL21, die voornamelijk wordt uitgescheiden door Tfh-cellen. IL21 reguleert rechtstreeks de ontwikkeling en productie van GC B-cellen van antilichamen met een hoge affiniteit, maar de rol ervan in Tfh-differentiatie is nog steeds controversieel7,8. PD-1 en CXCR5, die nu het meest worden gebruikt bij het identificeren van Tfh-cellen in flowcytometrie-analyse, spelen ook een belangrijke rol in de differentiatie en functie van deze subset. CXCR5 is de receptor van B-cel folliculaire chemokine en bemiddelt de lokalisatie van Tfh-cellen in B-celzakjes9. PD-1 is nu geïdentificeerd om niet alleen de folliculaire geleidingsfunctie te hebben, maar ook kritieke signalen over te brengen tijdens het proces van GC B-cellen affiniteitsrijping10. Op basis van deze bevindingen zou het evalueren van de expressie van deze moleculen in feite de rijping en functie van Tfh-cellen kunnen weerspiegelen.

GC is een geïnduceerde voorbijgaande microanatomische structuur in secundaire lymfoïde organen en sterk afhankelijk van Tfh-cellen, waardoor het een perfecte uitlezing is om de Tfh-respons te evalueren. In GC, na het ontvangen van signalen gemedieerd door cytokines en co-stimulatory moleculen, B cellen zijn onderworpen aan klasse schakelen en somatische hypermutatie om high-affinity antilichamen te genereren11. Differentiële antilichaamklasseschakeling vindt plaats in differentiële cytokine-niche, waarbij IL4 en IL21 IgG1-klasseschakeling induceren, terwijl IFNγ IgG2-klasseschakelinginduceert 12. Plasmacellen zijn de producenten van uitgescheiden antilichamen en zijn terminaal gedifferentieerde cellen. Net als Tfh-cellen wordt de ontwikkeling van B-cellen in GC geassocieerd met dynamische expressie van veel belangrijke moleculen. Op basis van de huidige studie kunnen GC B-cellen worden geïdentificeerd als B220+PNA+Fas+ of B220+GL7+Fas+ cellen en plasmacellen, in vergelijking met hun precursoren, downregulate expressie van B220 en upregulate CD138 expressie13. Bovendien kunnen beide kenmerken worden gedetecteerd in flowcytometrie en immunofluorescentieanalyse, waardoor de GC-respons op de juiste manier wordt geëvalueerd.

Robuuste cellulaire en humorale reacties worden geïnduceerd in influenzavirusinfectie, waarbij Tfh- en Th1-cellen CD4+ T-celrespons14domineren, waardoor het een perfect model is voor Tfh-cellen differentiatiestudie. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), een veelgebruikte muis-aangepaste stam, wordt vaak gebruikt in deze studie14,15,16. Hier beschrijven we enkele basisprotocollen van Tfh-studierelevante test bij influenzavirusinfectie: 1) intranasale inenting van pr8-virus; 2) antigeenspecifieke Tfh-cellen, GC B- en plasmacellen en IL21-detectie met stroomcytometrie; 3) histologische visualisatie van GC; 4) detectie van antigeenspecifieke antilichaamtiter in serum met ELISA. Deze protocollen bieden de nodige technieken voor nieuwe onderzoekers in Tfh-geassocieerde studie.

Protocol

Dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Institut Pasteur uit Shanghai, China. Alle experimenten werden uitgevoerd op basis van de door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde dierprotocollen. OPMERKING: Virusinfectie van muizen en isolatie van organen moeten worden uitgevoerd onder ABSL2-voorwaarde. 1. Inenting van PR8-influenzavirus en registratie van muizengewicht Bereid…

Representative Results

Karakterisering van de morbiditeit van de muis bij influenzavirusinfectieNa influenzavirusinfectie zijn muizen minder actief en anorexia als gevolg van ziekte, wat wordt weerspiegeld door ernstig gewichtsverlies, een veelgebruikt symptoom om de morbiditeit van de muis te controleren19. Zoals getoond in figuur 1a,begonnen met het PR8-virus geïnfecteerde muizen gewicht te verliezen op dag 6, bereikten het hoogste verliesniveau op …

Discussion

Vanwege gespecialiseerde rollen in het bieden van B-celhulp voor het genereren van antilichamen met een hoge affiniteit, zijn Tfh-cellen uitgebreid bestudeerd in de mechanismen van differentiatie en manipulatie om nieuwe strategieën voor het ontwerp van vaccins te bieden. Influenzavirusinfectie veroorzaakt krachtige Tfh- en GC B-celresponsen, waardoor het een geschikt model is voor dit onderzoeksveld. In dit artikel beschreven we protocollen van influenzavirusinfectie door intranasale inenting, evaluatie van Tfh-geassoc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken het personeel van flow cytometrie faciliteit, ABSL2 faciliteit en SPF dierlijke faciliteit van Institut Pasteur van Shanghai voor hun technische hulp en advies. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: Strategic Priority Research Program van de Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key R&D Program of China (2016YFA0502202), de National Natural Science Foundation of China (31570886).

Materials

Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6
37% formaldehyde Sigma F1635
Anti-CD16/32 mouse Thermo Fisher Scientific 14-0161-86
APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer NIH
Bcl-6 PE Biolegend 358504 clone:7D1
Biotin-CXCR5 Thermo Fisher Scientific 13-7185-82 clone: SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-0041-82 clone:GK1.5
CD44 eVolve 605 Thermo Fisher Scientifi 83-0441-42 clone:IM7
CD44 FITC Thermo Fisher Scientifi 11-0441-82 clone:IM7
CD62L FITC BD Pharmingen 553150 clone:MEL-14
ICOS BV421 Biolegend 564070 clone:7E.17G9
PD1 PE/Cy7 Biolegend 135216 clone:29F.1A12
Streptavidin BV421 BD Pharmingen 563259
Streptavidin PE BD Pharmingen 554081
Intracelluar staining of IL21
37% formaldehyde Sigma F1635
anti-human IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-605-098
Brefeldin A Sigma B6542
human FCc IL-21 receptor R&D System
ionomycin Sigma I0634
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit Thermo Fisher Scientific L34966
PMA Sigma P1585
Saponin MP 102855
GC B and plasma cells staining
B220 APC Thermo Fisher Scientific 17-0452-81 clone:RA3-6B2
CD138 PE BD Pharmingen 561070 clone:281-2
CD95 (FAS) PE/Cy7 BD Pharmingen 557653 clone:Jo2
IgD eFluor 450 Thermo Fisher Scientific 48-5993-82 clone:11-26c
PNA FITC Sigma L7381
Assay of HA-specific antibody titer with ELISA
PR8-HA Sino Biological 11684-V08H
BSA SSBC
Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) SouthernBiotech 5300-05
Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) SouthernBiotech 5300-05
Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) SouthernBiotech 5300-05
Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) SouthernBiotech 5300-05
Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) SouthernBiotech 5300-05
TMB Substrate Reagent Set BD Pharmingen 555214
Histology
Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG Life Technology A21434
anti-mouse IgD Biolegend 405702
biotinylated PNA Vector laboratories B-1075
dilute Alexa Fluor 488-streptavidin Life Technology S11223
normal goat serum SouthernBiotech 0060-01
Pro-long gold antifade reagent Thermo Fisher Scientific P3630
STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit Vector laboratories SP-2002

References

  1. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  3. Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  4. Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
  5. Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
  6. Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
  7. Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
  8. Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
  9. Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
  10. Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
  11. Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
  12. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
  13. Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
  14. Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
  15. Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
  16. He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
  17. León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
  18. Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
  19. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  20. Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
  21. Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  22. Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
  23. Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
  24. Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).

Play Video

Cite This Article
Wang, M., Huang, Y., Gu, W., Wang, H. Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (160), e60523, doi:10.3791/60523 (2020).

View Video