Summary

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

Published: April 15, 2020
doi:

Summary

Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.

Abstract

La microscopia intravitale (IVM) è ampiamente utilizzata per monitorare i processi fisiologici e patofisiologici all’interno della cascata di reclutamento di leucociti in vivo. Il protocollo attuale rappresenta un metodo pratico e riproducibile per visualizzare l’interazione con l’endotelio leucocito che porta al reclutamento di leucociti nel tessuto derivato dal muscolo scheletrico all’interno dell’organismo intatto del topo. Il modello è applicabile a tutti i campi di ricerca che si concentrano sull’attivazione dei noulociti e sul loro ruolo nella malattia.

Forniamo un protocollo passo dopo passo per guidare attraverso il metodo e per evidenziare potenziali insidie e difficoltà tecniche. Il protocollo copre i seguenti aspetti: impostazioni sperimentali e materiale richiesto, anestesia del topo, dissezione del muscolo cremaster così come cannulation tracheale e carotide, registrazioni IVM e analisi offline. Formati di dati come leucociti aderenti, flusso di rotolamento (RF) e frazione del flusso di rotolamento (RFF) sono spiegati in dettaglio e vengono discusse le applicazioni appropriate. Risultati rappresentativi da topi mdx carenti distrofina sono forniti nella sezione risultati.

IVM è un potente strumento per valutare il reclutamento di leucociti in un ambiente in vivo; tuttavia, delineare ad esempio la funzione endoteliale e leucocito può richiedere una combinazione con configurazioni ex vivo come esperimenti di camera di flusso. Inoltre, il background genetico degli animali di interesse può influenzare notevolmente il reclutamento di base, richiedendo la messa a punto individuale del protocollo previsto. Nonostante i suoi limiti, IVM può servire come piattaforma per tradurre prontamente i risultati in vitro in un organismo vertebrato vivente.

Introduction

La microscopia intravitale (IVM) è uno strumento comunemente applicato nel campo della biologia del leucocito. Il reclutamento di leukociti segue una cascata di eventi ben definiti iniziati dalla cattura del leucocito, dal rotolamento e dall’adesione al muro endoteliale, e infine dalla trasmigrazione e dall’estramigrazione dei leucociti nel sito effettivo di infiammazione1. Ogni passo è mediato e controllato da varie chemiochine (ad esempio, IL-8/CXCL8), recettori (ad esempio, LFA-1, Mac-1) e molecole di adesione delle cellule endoteliali corrispondenti (ad esempio, ICAM-1, VCAM-1 ed E-Selectin)2,3. L’interazione di diversi siti normativi, fattori di controllo e mediatori della cascata di reclutamento di leucociti come recettore dei prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE), della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1), del motivo C-X-C ligando (CXCL)1/2 e del loro recettore CXCR2 sono stati scoperti utilizzando IVM4,5,6,7,8,9.

Il metodo di IVM è stato descritto per molti organi e tessuti diversi come l’intestino10, pelle11, linfonodi12, il sacco di tuorlo embrionale13 e altri. Tuttavia, il metodo più studiato di IVM è il modello cremaster, descritto per la prima volta nei ratti14. Mentre ancora utilizzato nei ratti15, il metodo è oggi applicato principalmente nei topi a causa dell’alta abbondanza di diverse linee transgeniche. Il nostro gruppo ha recentemente evidenziato il potenziale ruolo del cremaster IVM nel campo delle muscolopatie infiammatorie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) che studiano topi immdxliti carenti di distrofina16. Grazie alla sua sottile composizione in fibra intrecciata e facilmente accessibile, il muscolo cremante rappresenta il muscolo candidato ideale da studiare come intero supporto utilizzando microscopia leggera o fluorescente. Il reclutamento e l’estravlocazione dei leonici avvengono principalmente in venule post-capillari, che possono essere facilmente identificate su uno strato muscolare continuo nel muscolo cremante.

Il vantaggio dell’imaging in vivo rispetto ad altri saggi in vitro è il suo contesto biologico in un organismo vivente. Allo stesso tempo, delineare contributi specifici per le cellule al reclutamento alterato dei leucociti può richiedere ulteriori modelli in vitro come camere di flusso o saggi endoteliali. La combinazione di più metodi produrrà i dati più convincenti. Gli scienziati dovrebbero essere consapevoli dei limiti del modello cremaster in quanto qualsiasi manipolazione chirurgica porterà ad un aumento del traffico e del reclutamento dei leucociti. Di conseguenza, l’assunzione di base è difficile da stimare con questo metodo. Nonostante la sua ampia applicazione, IVM del cremaster può essere impegnativo e una nuova configurazione può richiedere tempo e risorse per stabilire. Ora forniamo un protocollo facile che aiuterà a evitare alcuni degli errori comuni in IVM. Inoltre, le limitazioni saranno discusse e i metodi gratuiti saranno evidenziati ove applicabile.

IVM del cremaster rappresenta un approccio ideale da attuare nel campo degli studi infiammatori e infettivi. Più specificamente, il modello cremaster può essere di grande interesse per gli scienziati che studiano la biologia muscolare scheletrica nel contesto delle malattie infiammatorie.

Protocol

Gli animali erano ospitati in condizioni controllate e specifiche prive di agenti patogeni presso l’IBF (Interfakult’re Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dall’IRB locale e dal Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Germania. 1. Amministrazione dell’anestesia Anestesizzare il topo mediante iniezione di bolus intraperitoneale (i.p.) di 125 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilosina. Posiziona…

Representative Results

IVM in base al protocollo fornito fornirà informazioni uniche sulla cascata di reclutamento di leucociti nel muscolo scheletrico. La sezione dei risultati si concentrerà sui risultati tipici ottenuti da IVM ed evidenzierà i potenziali problemi che possono verificarsi. La configurazione sperimentale per la microscopia intravitale è descritta nella Figura 1. La preparazione del muscolo cremaster e la rimozione del tessuto connettivo è fondamentale per ottenere …

Discussion

IVM come metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare diversi tipi di cellule in diversi organi ed è stato ampiamente descritto e discusso19. L’obiettivo principale di questo studio è quello di fornire un approccio efficiente per impostare ed eseguire IVM nel muscolo cremaster. Praticare il metodo produrrà risultati affidabili e riproducibili. Pertanto, la pianificazione e la standardizzazione sono fattori chiave per padroneggiare la tecnica. Soprattutto, la tecnica dipende molto dai para…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell’istruzione e della ricerca (BMBF) 01GL1746E nell’ambito del Consorzio PRIMAL. Gli autori riconoscono Britta Heckmann e Silvia Pezer per un’abile assistenza tecnica.

Materials

Material
Ketanest S Pfizer Pharma GmbH PZN: 08509909 anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine
Xylazine CP-Pharma GmbH Article-nr.: 1205  anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)
Saline Solution B. Braun Melsungen  PZN 02737756 surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride
Syringe needle Omnican F B. Braun Melsungen  REF 9161502 surgical preparation 
Suture 6/0 USP Resorba REF 4217 surgical preparation 
Polyethylene tube #10  BD GmbH Supplier No. 427401 surgical preparation 
Polyethylene tube #90  BD GmbH Supplier No. 427421 surgical preparation 
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich Chemie GmbH CAS Number 989-38-8  leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate
Setup Equipment
Upright microscope  Olympus  BX51W1 microscopy
40-fold objective  Zeiss Achroplan 40 × /0.80 W microscopy
ImSpector software Lavision Biotec GmbH ver. 4.0.469 software
ImageJ National Institute of Health, USA ver. 1.51j8 software

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  2. Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
  3. Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
  4. Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
  5. Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
  6. Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
  7. Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
  8. Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
  9. Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
  10. Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  11. Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
  12. von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).
  13. Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
  14. Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
  15. Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
  16. Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
  17. Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
  18. Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
  19. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  20. Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kranig, S. A., Lajqi, T., Tschada, R., Braun, M., Kuss, N., Pöschl, J., Hudalla, H. Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (158), e60509, doi:10.3791/60509 (2020).

View Video