Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투
Summary
여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.
Abstract
Intravital 현미경 검사법 (IVM)는 생체 내에서 백혈구 모집 계단식 내의 생리적 및 병리생리학적 과정을 모니터링하는 데 널리 사용됩니다. 현재 프로토콜은 마우스의 손상되지 않은 유기체 내에서 골격 근 유래 조직에서 백혈구 모집으로 이어지는 백혈구 내피 상호작용을 시각화하는 실용적이고 재현 가능한 방법을 나타낸다. 이 모델은 과립구 활성화와 질병에서의 역할에 초점을 맞춘 모든 연구 분야에 적용됩니다.
우리는 방법을 안내하고 잠재적 인 함정과 기술적 인 어려움을 강조하기 위해 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 실험 설정 및 필수 물질, 마우스 마취, 크레마스터 근육 의 해부뿐만 아니라 기관 및 경동맥 통조림, IVM 기록 및 오프라인 분석을 다룹니다. 부착 백혈구, 롤링 플럭스(RF) 및 롤링 플럭스 분획(RFF)과 같은 데이터 형식에 대해 자세히 설명하고 적절한 응용 분야에 대해 설명합니다. 디스트로핀 결핍 mdx 마우스로부터의 대표적인 결과는 결과 섹션에 제공된다.
IVM은 생체 내 환경에서 백혈구 모집을 평가하는 강력한 도구입니다. 그러나, 예를 들어 내피 및 백혈구 기능을 delineating 유동 챔버 실험과 같은 전 생체 설정과 조합을 요구할 수 있습니다. 더욱이, 관심 있는 동물의 유전적 배경은 기준선 모집에 크게 영향을 미칠 수 있으며, 제공된 프로토콜의 개별적인 미세 조정을 요구한다. 그것의 한계에도 불구하고, IVM은 살아있는 척추 동물 유기체로 시험관 내 사실 인정을 쉽게 번역하는 단상으로 봉사할 수 있습니다.
Introduction
Intravital 현미경 검사법 (IVM)는 백혈구 생물학의 필드에 있는 일반적으로 적용되는 공구입니다. 백혈구 모집은 백혈구 포획, 압연 및 내피 벽에 의한 접착에 의해 시작된 잘 정의된 사건의 연속을 따르며, 마지막으로 염증의 실제 부위로 백혈구의 이주 및 사치를이월한다 1. 각 단계는 다양한 케모카인(예를 들어, IL-8/CXCL8), 수용체(예를 들어, LFA-1, Mac-1) 및 상응하는 내피 세포 접착 분자(예를 들어, ICAM-1, VCAM-1 및 E-Selectin)에 의해 매개및 조절된다2,,3. 상이한 조절 부위의 상호작용은, 백혈구 모집의 조절인자 및 중재자가 고급 당화 말단 제품(RAGE), 세포간 접착 분자 1(ICAM-1), C-X-C 모티프 리간드(CXCL)1/2 및 수용체 CXCR2를 사용하여 IVM,4,5,6,6,,7,,8,9를사용하여 발견하였다.
IVM의 방법은 장10,피부11,림프절12,배아 노른자 자루13 등과 같은 많은 상이한 장기 및 조직에 대해 기술되었다. 그러나, IVM의 가장 널리 연구된 방법은 래트14에서처음 기술된 크레마스터 모델이다. 쥐15에서아직도 아직도 이용되는 동안, 방법은 다른 형질전환 선의 높은 풍부 때문에 마우스에서 주로 최근에 적용됩니다. 우리 그룹은 최근 듀첸 근 이영양증 (DMD)과 같은 염증성 muscolopathies의 분야에서 cremaster IVM의 잠재적 인 역할을 강조하고 있다 dystrophin 결핍 mdx 마우스 를 공부16. 얇은 결합 및 쉽게 접근 할 수있는 섬유 조성으로 인해, cremaster 근육은 빛 또는 형광 현미경 검사법을 사용하여 전체 마운트로 연구 할 수있는 이상적인 후보 근육을 나타냅니다. 백혈구 모집 및 사치는 주로 cremaster 근육에 있는 연속적인 근육 층에 쉽게 확인될 수 있는 포스트 모세관 매경에서 일어날 것입니다.
생체외 에서 의 외 세포 내 세포 화상 진찰의 이점은 살아있는 유기체에 있는 그것의 생물학 문맥이다. 동시에, 변경된 백혈구 모집에 세포 특정 기여를 delineating 는 유동 실 또는 내피 검술과 같은 추가 시험관내 모형을 요구할 수 있습니다. 여러 메서드의 조합은 가장 설득력있는 데이터를 생성합니다. 어떤 외과 조작든지 증가한 백혈구 인신 매매 및 모집으로 이끌어 낼 것이기 때문에 과학자는 cremaster 모형의 한계를 알고 있어야 합니다. 따라서, 기준 모집은이 방법으로 추정하기 어렵다. 광범위한 응용 에도 불구하고, cremaster의 IVM은 도전이 될 수 있으며, 새로운 설정은 설정하는 데 시간과 자원이 걸릴 수 있습니다. 우리는 지금 IVM에서 일반적인 실수의 일부를 방지하는 데 도움이 될 것입니다 쉬운 프로토콜을 제공합니다. 또한 제한 사항에 대해 논의하고 해당되는 경우 무료 방법이 강조 표시됩니다.
cremaster의 IVM은 염증성 및 전염성 연구 분야에서 구현되는 이상적인 접근법을 나타낸다. 보다 구체적으로, cremaster 모형은 선동적인 질병의 맥락에서 골격 근육 생물학을 공부하는 과학자에 높은 관심사일지도 모릅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
방법으로서 IVM은 다른 기관에서 다른 세포 유형을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며 광범위하게 기술되고논의된 19. 이 연구의 주요 목적은 cremaster 근육에서 IVM을 설정하고 수행하는 효율적인 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이 방법을 연습하면 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 따라서 계획 및 표준화는 기술을 마스터하는 핵심 요소입니다. 무엇보다도 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 PRIMAL 컨소시엄의 일환으로 독일 연방 교육 연구부 (BMBF) 01GL1746E에 의해 지원되었다. 저자는 숙련 된 기술 지원에 대한 브리타 헤크만과 실비아 페저를 인정합니다.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
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