En detaljerad metod finns här som beskriver rening, refolding, och karakterisering av självassemblerande proteinnanopartiklar (SAPNs) för användning i vaccinutveckling.
Självassemblerande proteinnanopartiklar (SAPNs) fungerar som repetitiva antigen skärmar och kan användas för att utveckla ett brett spektrum av vacciner för olika infektionssjukdomar. I denna artikel visar vi en metod för att producera en SAPN kärna som innehåller en sex-Helix bunt (SHB) församling som kan presentera antigener i en trimeric konformation. Vi beskriver uttrycket av SHB-SAPN i ett E. coli -system, liksom de nödvändiga protein reningsstegen. Vi inkluderade en isopropanol tvätta steg för att minska resterande bakteriell lipopolysackarid. Som en indikation på protein identitet och renhet, proteinet reagerade med kända monoklonala antikroppar i västerländska blot analyser. Efter uppfällning, föll storleken på partiklarna i det förväntade intervallet (20 till 100 nm), vilket bekräftades av dynamisk ljusspridning, nanopartiklar spårningsanalys, och transmissionselektronmikroskopi. Den metod som beskrivs här är optimerad för SHB-SAPN, men med endast smärre ändringar kan den tillämpas på andra SAPN konstruktioner. Denna metod är också lätt att överföra till storskalig produktion för GMP-tillverkning för humanvaccin.
Medan traditionell vaccinutveckling har fokuserat på inaktiverade eller försvagade patogener, har fokus för moderna vacciner skiftat mot subenhet vacciner1. Detta tillvägagångssätt kan leda till ett mer målinriktat svar och potentiellt mer effektiva vaccinkandidater. Men en av de viktigaste nackdelarna är att subenhet vacciner inte partiklar som hela organismer som kan resultera i minskad immunogenicitet2. En nanopartikel som ett repetitivt antigen visningssystem kan ha fördelarna med både den riktade subenhet-vaccinmetoden samt partikel karaktären hos hela organismen1,3.
Bland de befintliga typerna av nanovaccines, rationellt utformade protein sammansättningar möjliggör utformning och utveckling av vaccinkandidater som kan presentera flera kopior av antigen potentiellt i en infödd-liknandekonformation1,4 ,5,6. Ett exempel på dessa protein sammansättningar är självassemblerande proteinnanopartiklar (SAPNs)7. SAPNs är baserade på coiled-Coil domäner och är traditionellt uttrycks i Escherichia coli8. Sapn-vaccinkandidater har utvecklats för en rad olika sjukdomar som malaria, sars, influensa, toxoplasmos, och hiv-19,10,11,12,13 , fjorton , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. utformningen av varje sapn kandidat är specifik för patogenen av intresse, dock, produktion, rening och omläggning tekniker är i allmänhet i stort sett tillämpliga.
Ett av våra nuvarande intressen är ett effektivt HIV-1-vaccin. I RV144 – den enda kliniska fas III-prövningen av ett hiv-1-vaccin som visade måttlig effekt – var den minskade infektionsrisken korrelerad med IgG-antikroppar mot V1V2-slingan av kuvert proteinet20,21. Den infödda-liknande trimeric presentationen av denna region tros vara viktig för skyddande immunogenicitet22. För att presentera V1V2 loop i så nära infödda-liknande konformation som möjligt, vi utvecklat ett bevis på principen SAPN vaccinkandidat som innehöll HIV-1 kuvert efter fusion Six-Helix Bundle (SHB) att presentera V1V2 slingan i rätt konformation9 . Denna kandidat erkändes av kända monoklonala antikroppar mot HIV-1 kuvert protein. Möss immuniserade med V1V2-SHB-sapn upp V1V2 specifika antikroppar, som, viktigast av allt, bunden till gp70 V1V2, rätt överensstämande epitoper9. SHB-SAPN Core kan ha andra funktioner utöver rollen som bärare för HIV-1 V1V2 loop. Här beskriver vi en detaljerad metodik för uttrycket, rening, refolding, och validering av SHB-SAPN kärna. Sekvensvalet, nanopartiklar-designen, den molekylära kloningen och omvandlingen av E. coli har beskrivits tidigare9.
Nanoteknik ger många fördelar och lösningar för subenhet vaccinutveckling. Nanovaccines kan upprepade gånger presentera antigener som partiklar till värd immunsystemet ökar immunogeniciteten26. Även om det finns många olika typer av nanovaccines, tror vi att de som består av de Novo utformat protein verkar vara den starkaste metoden för vaccinutveckling1. De kan vara konstruerade utan någon sekvens homologi till värden proteiner och presentera antigen av intresse i nära infödda-liknande konformation samtidigt som låg produktionskostnad och hög produkt avkastning. Ett utmärkt exempel på detta tillvägagångssätt är SAPN teknik, som vi har tillämpat på vacciner mot flera infektionssjukdomar7. Ta itu med svårigheterna i HIV-1 vaccinutveckling, har vi konstruerat en unik SHB-SAPN kärna för att effektivt presentera V1V2 antigen i en infödd-liknande trimeric konformation9. Många vaccin mål, särskilt för virussjukdomar, är närvarande som trimerer27. Detta fenomen indikerar att vår sapn design har stora konsekvenser för utvecklingen av subenhet vacciner.
I den här metoden visar vi hur man producerar SHB-SAPNs i ett E. coli -uttryckssystem. Vi uttryckte hög avkastning av protein (om 6 mg/100 mL kultur). Proteinet innehöll 10 histidines och var lättrenat med hjälp av en immobiliserad metallaffinitetskromatografi med ni2 + kolonn. Denna längd av hans-taggen konstaterades vara den optimala för den högsta protein avkastningen. Det renade proteinet innehöll full längd av det designade proteinet, vilket indikeras av närvaron av både N-terminalen HisTag och C-terminalen heptad REPEAT. Vi utnyttjade allmänt accepterade tekniker och optimerade dem för uttryck, produktion och karakterisering av SHB-SAPN kärna. Brist av produktionen av det hellångt protein under utvecklingen av en sapn som innehåller ett nytt protein epitop kunde indikera ett uttrycks problem av genen i den värdcellen. Om det händer måste genen och uttrycks systemet omformas och anpassas till det beskrivna protokollet. Modifiering av ultraljudsbehandling tid eller intensitet kan också öka koncentrationen av det förutspådda fullängds proteinet.
Omvikta partiklar var i det förväntade storleksintervallet (20 till 100 nm)8,24,25 som bestäms av DLS och nanopartiklar spårningsanalys. Dessa resultat bekräftades ytterligare med hjälp av TEM. Om det finns problem i detta steg, är det normalt på grund av ett problem med pH eller jonisk styrka av vika buffert. När stor storlek partiklar upptäcks på partikel dimensionering tekniker, det indikerar aggregering, som kan undvikas genom att öka pH i vika buffert. Om partiklarna inte upptäcks av DLS, kontrollera koncentrationen av proteinet och kontrollera pH i bufferten. Den slutliga protein koncentrationen för DLS bör vara minst 100 μg/mL. Om koncentrationen inte är problemet, indikerar det överflödet av små, ofullständigt bildade partiklar, vars koncentration kan reduceras genom att minska pH. Alternativt kan natriumkloridkoncentrationen justeras till det optimala intervallet för att minimera närvaron av partiklar med oönskad storlek.
Slutligen, genom att använda en isopropanol tvätta steg under rening vi kunde minska kontaminerande LPS från värden E. coli till 0,01 EU/μg av sapn som är under Food and Drug Administration (FDA) gräns på 5 EU/kg kroppsvikt för injicerbara produkter 28. denna nivå kan minskas ytterligare genom att använda en anjonväxling kolumn även känd som Q kolumn. Om höga halter av endotoxin fortfarande finns, kontrollera alla material som användes för att förbereda buffert. Kom ihåg att endast använda depyrogenated glas och endotoxin fri plasticware i denna metod.
Dessa resultat indikerar att vi framgångsrikt har utvecklat en metod för att producera SHB-SAPN kärna som kan användas för prekliniska immuniseringsstudier. Denna metod med endast smärre ändringar, om någon, kan tillämpas på rening av SHB-SAPNs när ett antigen av intresse tillsätts. Med den här metoden som utgångspunkt är en av de stora förändringarna i elutionssteget. Olika proteiner eluera vid olika imidazolkoncentrationer som måste bestämmas experimentellt. Den andra stora skillnaden kan vara sammansättningen av vika buffert. Optimering skulle kräva att testa olika pH-förhållanden samt Joniska styrkor.
Med tanke på det framtida arbetet behövs endast två smärre modifieringar för att möjliggöra mänsklig tillämpning av SHB-SAPN. Den första är att uttrycket vektorn måste ändras till ett kanamycin motstånd valbar markör på grund av ampicillin allergi hos människor29. Det andra stora kravet på proteintillverkning för humant bruk är att producera SHB-SAPN i animaliska produkter-fria medier. En småskalig studie indikerade redan en rimlig avkastning av protein i en växtbaserad media. Det arbete som presenteras här är lätt skalbar för ultimat GMP produktion som demonstreras med en malariavaccin kandidat, FMP01416. Denna storskaliga FMP014-SAPN produktion ingår både anjonbyte och cation Exchange steg för att ytterligare minska LPS och ni2 + innehåll från slutprodukten. Denna bakterie-uttryckt SAPN har redan skalats upp för en kommande fas 1/2a klinisk prövning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett samarbetsavtal (W81XWH-11-2-0174) mellan Henry M Jackson Foundation för befordran av militär medicin, Inc., och det amerikanska försvarsdepartementet. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV antikropp mottogs från Dr Susan Zolla-Pazner genom NIH AIDS reagens program.
10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |