백신 개발에 사용하기 위한 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)의 정제, 재접이식 및 특성화를 설명하는 상세한 방법이 여기에 제공된다.
자가 조립 단백질 나노 입자 (SAPN) 반복항원 디스플레이로 기능하고 다른 감염성 질환에 대한 백신의 넓은 범위를 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 트리메라 형태에서 항원을 제시할 수 있는 6-나선 번들(SHB) 어셈블리를 포함하는 SAPN 코어를 생산하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 대장균 시스템에서 SHB-SAPN의 발현뿐만 아니라 필요한 단백질 정제 단계를 설명합니다. 잔류 세균성 리포폴리사카라이드를 감소시키기 위한 이소프로판올 세척 단계를 포함시켰습니다. 단백질 정체성 및 순도의 표시로서, 단백질은 서양 블롯 분석에서 알려진 단일 클론 항체와 반응했다. 재접이식 후, 입자의 크기는 동적 광 산란, 나노 입자 추적 분석 및 투과 전자 현미경으로 확인된 예상 범위(20~100 nm)로 떨어졌다. 여기서 설명하는 방법은 SHB-SAPN에 최적화되어 있지만 약간의 수정만으로 다른 SAPN 구문에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 인간 백신을 위한 GMP 제조를 위한 대규모 생산으로 쉽게 양도할 수 있습니다.
전통적인 백신 개발은 불활성화 또는 감쇠된 병원체에 초점을 맞추고 있는 동안, 현대 백신의 초점은하위 단위 백신으로 이동했습니다 1. 이 접근은 더 표적으로 한 반응으로 이끌어 낼 수 있고, 잠재적으로 더 효과적인 백신 후보자. 그러나, 주요 단점 중 하나는 소단위 백신이 감소 된 면역 원성 2를 초래할 수있는 전체유기체와 같은 미립자되지 않는다는 것입니다. 반복적 항원 디스플레이 시스템으로서의 나노입자는 전체 유기체의 미립자 성질뿐만 아니라 표적 소단위 백신 접근법 모두의 이점을 가질 수있다1,3.
기존의 나노백신 중에서 합리적으로 설계된 단백질 어셈블리는 항원의 여러 사본을 네이티브 와 같은 형태에서 잠재적으로 제시할 수 있는백신 후보의 설계 및 개발을 가능하게 합니다 1,4 ,5,6. 이들 단백질 어셈블리의 한 예로는 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)7이있다. SAPN은 코일 코일 도메인을 기반으로 하며 전통적으로 대장균8로표현됩니다. SAPN 백신 후보기는 말라리아, 사스, 인플루엔자, 톡소플라즈마증 및 HIV-1 9,10,11,12,13 과 같은 다양한 질병에 대해 개발되었습니다. , 14세 , 15세 , 16세 , 17세 , 18세 , 19. 각 SAPN 후보의 설계는 관심 있는 병원체에 특정하지만, 생산, 정제 및 재접공 기술은 일반적으로 광범위하게 적용가능하다.
우리의 현재 관심사 중 하나는 효과적인 HIV-1 백신입니다. RV144에서- 적당한 효험을 설명한 HIV-1 백신의 유일한 단계 III 임상 시험은 감염의 감소된 리스크는 봉투 단백질20,21의V1V2 루프에 IgG 항체와 상관되었습니다. 이 지역의 네이티브 유사 트리메라 프리젠 테이션은 보호 면역 원성22에중요하다고 생각됩니다. V1V2 루프를 가능한 한 네이티브 와 같은 형태에 가깝게 제시하기 위해, 우리는 올바른 형태 9로 V1V2 루프를 제시하기 위해 HIV-1 봉투 후 융합 6 나선 번들 (SHB)을 포함하는 원리 SAPN 백신 후보의 증거를 개발했습니다. . 이 후보는 HIV-1 봉투 단백질에 공지된 단일클론 항체에 의해 인식되었다. V1V2-SHB-SAPN으로 면역화된 마우스는 V1V2 특이적 항체를 제기했으며, 가장 중요한 것은, gp70 V1V2에 바인딩되어, 정확한 형태 에피토프9. SHB-SAPN 코어는 HIV-1 V1V2 루프의 캐리어 역할을 넘어서는 다른 기능을 가질 수 있습니다. 여기서는 SHB-SAPN 코어의 발현, 정제, 재접기 및 유효성 검사에 대한 자세한 방법론을 설명합니다. 서열 선택, 나노입자 설계, 분자 복제, 및 대장균의 변형은 이전에9에기술되어 있다.
나노 기술은 하위 단위 백신 개발을위한 많은 장점과 솔루션을 제공합니다. 나노백신은 항원을 숙주 면역계통에 미립자로 반복적으로 제시하여 면역원성을 증가시키는26. 나노 백신의 많은 다른 모형이 있는 동안, 우리는 de novo 디자인한 단백질로 구성된그들 백신 발달을 위한 강한 접근이 될 것 같다는 것을 믿습니다 1. 그(것)들은 호스트 단백질에 어떤 순서 상동성도 없이 설계되고 낮은 생산 비용 및 높은 제품 수율을 제공하면서 네이티브 같이 형성에 가까운 관심의 항원을 제시할 수 있습니다. 이 접근법의 대표적인 예는 여러 전염병에 대한 백신에 적용한 SAPN 기술 7입니다. HIV-1 백신 개발의 어려움을 해결하기 위해, 우리는 효과적으로 네이티브 같은 트리메라 형태 9에서 V1V2 항원을제시하기 위해 독특한 SHB-SAPN 코어를 설계했다. 많은 백신 표적, 특히 바이러스 성 질환에 대한, 트리머 (27)로 존재한다. 이 현상은 우리의 SAPN 설계가 하위 단위 백신의 개발에 광범위한 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.
이 방법에서는 대장균 발현 시스템에서 SHB-SAPNS를 생성하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 단백질의 높은 수율을 표현 (약 6 mg/100 배양의 mL). 단백질은 10개의 히스티딘을 함유하고Ni2+ 컬럼을 이용한 고정화 금속 친화도 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 정제되었다. His-Tag의 이 길이는 가장 높은 단백질 수율에 최적인 것으로 나타났습니다. 정제된 단백질은 N-말단 HisTag 및 C 말단 heptad 반복의 존재에 의해 지시된 바와 같이 설계된 단백질의 전체 길이를 함유하였다. 우리는 널리 인정되는 기술을 활용하고 SHB-SAPN 코어의 표현, 생산 및 특성화에 최적화했습니다. 새로운 단백질 에피토프를 함유하는 SAPN의 개발 동안 전신 단백질의 생산부족은 숙주 세포에서 유전자의 발현 문제를 나타낼 수 있었다. 이 경우 유전자 및 발현 시스템은 기재된 프로토콜에 맞게 재설계및 조정되어야 합니다. 초음파 처리 시간 또는 강도의 변형은 또한 예측된 전체 길이 단백질의 농도를 증가시킬 수 있다.
재접립된 입자는 DLS 및 나노입자 추적 분석에 의해 결정된 바와 같이예상크기 범위(20~ 100 nm) 8,24,25였다. 이러한 결과는 TEM을 사용하여 추가로 확인되었다. 이 단계에서 문제가 있는 경우, 일반적으로 재접이식 버퍼의 pH 또는 이온 강도에 대한 문제 때문입니다. 입자 크기 조정 기술에서 큰 크기의 입자가 감지되면 재접이식 버퍼의 pH를 증가시켜 피할 수 있는 집계를 나타냅니다. 입자가 DLS에 의해 검출되지 않으면 단백질의 농도를 확인하고 버퍼의 pH를 확인하십시오. DLS에 대한 최종 단백질 농도는 적어도 100 μg/mL이어야 합니다. 농도가 문제가되지 않는 경우, 그것은 그 농도가 pH를 감소시킴으로써 감소 될 수있는 작고 불완전하게 형성 된 입자의 풍부를 나타냅니다. 대안적으로, 염화나트륨 농도는 원치 않는 크기의 입자의 존재를 최소화하기 위해 최적의 범위로 조절될 수 있다.
마지막으로, 정화 중에 이소프로판올 세척 단계를 사용하여 주사용 제품에 대한 체중 5 EU/kg의 미국 식품의약국(FDA) 한도 미만인 SAPN의 호스트 대장균에서 오염되는 LPS를 0.01 EU/μg로 줄일 수 있었습니다. 28. 이 레벨은 Q 열이라고도 하는 음이온 교환 열을 사용하여 더 줄일 수 있습니다. 높은 수준의 내독소가 여전히 존재하는 경우 버퍼 준비에 사용 된 모든 재료를 확인하십시오. 이 방법은 depyrogenated 유리 제품 및 내독소 무료 플라스틱 제품을 사용하는 것을 기억하십시오.
이러한 결과는 전임상 예방 접종 연구에 사용될 수 있는 SHB-SAPN 코어를 생산하는 방법을 성공적으로 개발했음을 나타냅니다. 이 방법은 약간의 변형만으로, 만약 있는 경우, 관심 있는 항원이 첨가될 때 SHB-SAPN의 정제에 적용될 수 있다. 이 방법을 시작점으로 사용하는 것은 용출 단계에 있습니다. 다른 단백질은 실험적으로 결정되어야 하는 다른 imidazole 농도에서 용해됩니다. 다른 주요 차이점은 다시 접는 버퍼의 구성일 수 있습니다. 최적화를 위해서는 이온 강도뿐만 아니라 다양한 pH 조건을 테스트해야 합니다.
향후 작업을 고려하여 SHB-SAPN을 인간으로 적용하려면 두 가지 약간의 수정만 필요합니다. 첫 번째는 인간29의암피실린 알레르기로 인해 발현 벡터가 카나마이신 저항성 선택 가능한 마커로 변경될 필요가 있다는 것이다. 인간 사용을 위한 단백질 제조의 다른 주요 요구 사항은 동물성 제품 없는 매체에서 SHB-SAPN을 생산하는 것입니다. 소규모 연구는 이미 식물 기반 매체에서 단백질의 합리적인 수율을 나타냈다. 여기에 제시된 일은 말라리아 백신 후보, FMP01416으로입증된 바와 같이 궁극적인 GMP 생산을 위해 쉽게 확장가능합니다. 이 대규모 FMP014-SAPN 생산에는 음이온 교환 및 양이온 교환 단계가 모두 포함되어 있어 최종 제품에서 LPS 및 Ni2+ 함량을 더욱 감소시켰습니다. 이 세균 성 발현 SAPN은 이미 곧 단계 1/2a 임상 시험을 위해 확장되었습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 군사 의학의 발전을위한 헨리 M 잭슨 재단 사이의 협력 협정 (W81XWH-11-2-0174)에 의해 지원되었다, Inc., 미국 국방부. 항 HIV-1 gp41 mAb 167-D IV 항체는 NIH 에이즈 시약 프로그램을 통해 수잔 졸라-파스너 박사로부터 받았다.
10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |