大肠杆菌-表达自组装蛋白纳米颗粒的生产，用于需要三聚体异体的疫苗

1. 大肠杆菌BL21（DE3）中SHB-SAPN蛋白的表达 按照制造商的说明，将介质中部件 A 的 95 mL 和介质 B 组件的 5 mL 混合到 2 L 无菌玻璃 Erlenmeyer 烧瓶中（参见材料表）。将安西林添加到100μg/mL的最终浓度中。 用大肠杆菌从先前建立的甘油库存培养基中接种介质。在 30°C 下孵育培养，以每分钟 200 次旋转 （rpm） 摇动 48 小时。注：所使用的大肠杆菌BL21（DE3）库存含有耐异氯联素表达载体23与SHB-SAPN基因。 虽然介质的一般方案建议在37°C下孵育24小时，但30°C的48小时孵育为SHB-SAPN提供了更高的产量。 将培养体转移到两个 50 mL 锥形管中。在 4，000 x g下将管离心 10 分钟，在 4°C 下使用固定角度转子。去除上清液并保存颗粒以收获细胞。注：细胞颗粒可以立即处理或在-80°C冷冻，直到使用。 2. 大肠杆菌BL21（DE3）通过声波的解压 注：使用在250°C下烘烤的非热性塑料制品和玻璃器皿至少30分钟。 Tris（2-carboxyhyl）磷化物（TCEP）作为还原剂，可破坏蛋白质内部和蛋白质之间的二硫化物粘结。如果显示的抗原含有S-S键，则在此协议期间的缓冲液中需要TCEP。仅对于 SHB-SAPN 内核，在缓冲区中不存在 TCEP 并不是必须的。 制备无氧缓冲液（8 M 尿素、50 mM 磷酸钠单基、20 mM Tris 底座、5 mM TCEP）pH 8.0（使用 5 N NaOH 调节），并使用 0.22 μm 真空瓶过滤单元对其进行过滤。 在一个 50 mL 锥形管中，使用 40 mL 的无 imidazol 缓冲液重新悬浮颗粒细胞（从步骤 1.3 开始）。用探针在冰上声波5分钟（4秒的声波，6秒的静止），声波输出为150W。 在4°C下将细胞液化液（40 mL）在29，000 x g下离心25分钟，在固定角度转子中产生澄清的上清液。将上清液转移到 150 mL 无菌烧瓶中并丢弃颗粒。使用无 imidazol 缓冲液（在协议中稍后称为”样品”）将上清液稀释至 100 mL。注： 此稀释步骤是为了防止 FPLC 系统压力在列上的裂化加载过程中变得过高。 3. 使用他柱进行蛋白质纯化 注：此协议是使用FPLC仪器执行的，但可以适应重力流。 准备以下缓冲液并使用0.22 μm真空瓶过滤装置进行过滤：（i） 无二甲苯缓冲液”缓冲A”（8M尿素，50mM磷酸钠单基，20 mM Tris底座，5 mM TCEP）pH 8.0;（ii） 500 mM imidazole 缓冲液”缓冲 B”（8 M 尿素、50 mM 磷酸钠单基、20 mM Tris 碱、5 mM TCEP、500 mM Imidazole） pH 8.0;和 （iii） 异丙醇洗涤 （20 mM Tris， 60% 异丙醇） pH 8.0.注：每个缓冲器的pH被调整为5 N NaOH。 平衡他的列。注：对于实验室规模生产，此协议使用 5 mL 预包装的 His 列，但可以使用任何较大的列。 打开 FPLC 软件并单击”新方法”选项。它将立即打开到”方法设置”菜单。在列位置的下拉菜单下，选择C1 端口 3。 在”按技术显示”下拉菜单中选择亲和力。在列类型下拉菜单中选择其他，Histrap HP，5 mL。列体积和压力箱将自动设置为相应的值。 单击”方法大纲”按钮。从”阶段”库弹出式菜单中拖动以下按钮：平衡、示例应用、列洗和按该确切顺序在箭头旁边洗脱。关闭”阶段库”菜单。 单击平衡按钮。表中列出的值应为”初始缓冲区 B”（4%）、”最终缓冲区 B”（4%）和”卷 （CV）”5。 单击”示例应用程序”框。在样品加载框中，单击带样品泵的列上注入样品的单选按钮。确保使用系统泵盒的样品喷射中选中了方法设置中的”使用流量”旁边的框。屏幕右侧的音量框旁边，将值更改为20 mL。 单击”列”洗涤按钮。表中列出的值应为”初始缓冲区 B”（4%）、”最终缓冲区 B”（4%）和”卷 （CV）”5。分数收集方案旁边取消单击”启用”框。 单击洗脱按钮。表中列出的值应为”初始缓冲区 B”0%、”最终缓冲区 B”100%和”卷 （CV）”5。分数收集方案旁边单击”启用”框。在下面的填充框中取消单击”使用方法设置中的小数大小”，并将分数大小调整为 4 mL。 单击软件顶部的”保存为”按钮。为文件命名”平衡”。 将 5 mL 预包装的 His 列连接到 FPLC 上的相应列端口 3。泵 A 和泵 B 油管以及样品泵管应放入 0.22 μm 过滤脱离子水中。运行平衡程序。 将泵 A 和泵 B 以及样品泵管放入无 imidazole 缓冲液 （Buffer A） 中，然后再次运行平衡协议。 将样品与柱上结合并纯化蛋白质。打开 FPLC 软件并单击”新方法”选项。它将立即打开到”方法设置”菜单。在列位置的下拉菜单下，选择C1 端口 3。在”按技术显示”下拉菜单中选择亲和力。在列式下拉菜单中选择其他，Histrap HP，5 mL。列体积和压力箱将自动设置为相应的值。 单击”方法大纲”按钮。从”阶段库”弹出式菜单中拖动按钮：平衡、示例应用、列洗（洗涤 1）、列洗（洗涤 2）、列洗（洗涤 3）和其中箭头旁边的洗脱确切的顺序。关闭”阶段库”菜单。 单击”平衡”按钮。表中列出的值应为”初始缓冲区 B”4%、”最终缓冲区 B”4%和”卷 （CV）”5。 单击”示例应用程序”框。在样品加载框中，单击带有样品泵的列上的I nject 样品的单选按钮。确保使用系统泵盒的样品喷射中选中了方法设置中的”使用流量”旁边的框。 屏幕右侧的音量框旁边，将值更改为 100 mL。分数收集方案旁边单击”启用”按钮。取消单击”使用方法设置”框中的”使用分数大小”，然后将分数大小更改为 4 mL。 单击第一列洗涤按钮（洗涤 1）。表中列出的值应为”初始缓冲区 B”4%、”最终缓冲区 B”4%和”卷 （CV）”10。分数收集方案旁边单击”启用”框。取消单击方法设置中的”使用分数大小”，然后将分数大小更改为 4 mL。 单击第二列洗涤按钮（洗涤 2）。表中列出的值应为”初始缓冲区 B”0%、”最终缓冲区 B”0%和”卷 （CV）”5。分数收集方案旁边单击”启用”框。取消单击方法设置中的”使用分数大小”，然后将分数大小更改为 4 mL。 单击第三列洗涤按钮（洗涤 3）。表中列出的值应为”初始缓冲区 B”0%、”最终缓冲区 B”0%和”卷 （CV）”5。分数收集方案旁边单击”启用”。 取消单击”使用方法设置”框中的”使用分数大小”，然后将分数大小更改为 4 mL。 单击”洗脱”按钮。在表格中右键单击列出的信息，并在上一步的菜单上单击”删除步骤”。将异种渐变按钮拖到表上两次，以便有两个条目。 第一个条目的值应为”初始缓冲区 B” 30%、”最终缓冲区 B”30%和”卷 （CV）”10。第二个条目的值应为”初始缓冲区 B” 100%、”最终缓冲区 B”100%和”卷 （CV）”10。分数收集方案旁边单击”启用”按钮。单击”使用方法设置中的小数大小”旁边的框。 单击软件顶部的”另存为”按钮。命名文件”净化”。泵 FPLC 的 A 管应放入无 imidazol 洗涤缓冲液中，而泵 B 管应放入 500 mM imidazole 缓冲液中。样品泵管应放入 100 mL 样品中。 运行”净化”程序，等待需要 60% 异丙醇的时间（Wash 2）。暂停程序，将泵 A 管从无异丙醇洗涤液移入 60% 异丙醇洗涤中。重新启动程序。 异丙醇步骤完成后，再次暂停程序，并将泵 A 管移回无异丙酮洗涤缓冲液中。重新启动净化程序（其余运行是自动的）。 4. 通过SDS-PAGE进行纯度评估和蛋白质鉴定 结合所有与 （i） 流通（未绑定到他的柱的细胞流源）对应的所有分数，（ii） 洗涤 1，（iii） 洗涤 3 （60% 异丙醇洗涤），和 （iv） 在单独的 50 mL 锥形管中洗涤 3。不要合并洗脱步骤中的 2 mL 分数。 将每个池分馏分和洗脱步骤中的所有馏分中15μL与2xLaemmli样品缓冲液混合在0.5 mL微离心管中，并在95°C下变性10分钟。 当蛋白质变性时，在1xTris-甘氨酸SDS-PAGE运行缓冲液中设置3个无污渍的4⁄20%预制聚丙烯酰胺凝胶的凝胶运行装置。 将分子量标记的8μL加载到第一口井，将30μL的变性样品加载到凝胶的其他井中。以 200 V 的速度运行凝胶，直到染料正面击中凝胶底部（约 30 分钟）。从设备中取出凝胶，然后用去离子水短暂冲洗。使用无污渍成像系统立即对凝胶进行成像。 识别含有正确大小（18.07 kDa）的蛋白质带的分数。汇集所有这些分数。 5. 蛋白质识别由西方污点 使用他特异性抗体（抗6x HisTag）和SHB特异性抗体（167-D-IV）运行一个西体标记，以识别纯化的全长蛋白。抗6x HisTag抗体识别蛋白质的N终点，167-D-IV抗体识别C终点，证明全长蛋白的存在。 确定 （i） 流通、（ii） 洗涤 1、（iii） 洗涤 2 （60% 异丙醇洗涤）、（iv） 洗涤 3 和从光谱仪在 280 nm 的吸光度下洗脱步骤中的所有分数。在15 μL的无酰胺酶缓冲液中产生含有100 ng蛋白质的稀释剂。 将15μL的2x莱姆利样品缓冲液添加到每个15μL的样品中，并像步骤4.1那样变性。变性完成后，旋转管，以确保所有蛋白质可以转移。 将样品和预染色标记物装入无污渍的4-20%预制聚丙烯酰胺凝胶中。在 200 V 下运行电泳，直到染料正面到达凝胶底部。 当凝胶运行时，在 TBS-T 中生产 1 L 的 TBS-T（20 mM Tris、150 mM NaCl 和 0.1% 补间 20）和 200 mL 的 5% 非脂牛奶。 使用西印带转移系统将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。使用预组装的转移堆栈，并将凝胶放在其上。设置系统以 25 V 运行 7 分钟。检查硝基纤维素膜上是否存在预染色标记，指示完全转移。注： 所有后续步骤在室温 （RT） 设置为 100 rpm 的轨道摇床上执行。 传输完成后，用 TBS-T 洗涤两次，每次 10 分钟。 用TBS-T中的5%无脂牛奶块附硝基纤维素膜（斑点），至少1小时。用TBS-T清洗两次，每次10分钟。 在 TBS-T（库存 Ab）中稀释原发性 167-D-IV 和抗 6x HisTag 抗体至 1 mg/mL。将库存 167-D-IV 10，000 倍和抗 6x HisTag 5，000 倍的库存 Abs 稀释，将库存 167-D-IV 和 4 μL 的库存抗 6x HisTag 抗体的 2 μL 添加到两个包含 20 mL TBS-T 的不同管中。将原抗体的总体积20 mL，每个斑点一个，孵育1小时。用TBS-T洗涤2次，10分钟。 在20 mL TBS-T（1：5，000稀释）中稀释小鼠抗人二级抗体与碱性磷酸酶结合的4 μL，即1mg/mL。在 20 mL TBS-T （1：5，000 稀释） 中稀释 4 μL 的 1 mg/mL 山羊抗小鼠二级抗体与碱性磷酸酶结合。将二级抗体添加到相应的血块。注：抗人类二级抗体与167-D结合，抗小鼠与抗6xHisTag结合。用 TBS-T 洗涤 2 次，10 分钟。 加入足够的BCIP/NBT碱性磷酸酶基板，以覆盖布带。开发污点约10分钟，直到带出现。用冷水冲洗冲泡，让它们干燥，然后用平板扫描仪扫描。 6. 重新折叠 SHB-SAPN 将汇集的蛋白质（共10μu201220 mL）加入10 kDa分子量切断透析盒，并将其透析成8M尿素，20mM Tris，5%甘油，5mM TCEP pH 8.5在RT（18\u201226 °C）过夜。 通过将透析缓冲液中的尿素浓度每 2 小时递减 2 M，缓慢地将尿素从样品中剥离。在尿素浓度为2 M时，将透析装置移至4°C（不要从此步骤中使用透析缓冲液中的TCEP）。在4°C过夜时，将样品透析成120 mM尿素、20 mM Tris、5%甘油、pH 8.5，完成再折叠。 从透析盒中取出重新折叠的蛋白质（SHB-SAPN）。使用 0.22 μm 聚氯乙烯 （PVDF） 注射器文件。将SHB-SAPN亚分到无菌管中，将其冷冻在-80°C，在RT处留下至少100μL，以便后续分析。 7. 按尺寸和外观验证粒子 动态光散射 （DLS） 通过以下参数测量 SHB-SAPN 的平均粒径：选择蛋白质作为材料，为 120 mM 尿素、20 mM Tris、5% 甘油 25°C 温度创建复合缓冲液，选择一次性比色皿进行分析，选择自动测量，设置为 5 次运行。 将 45 μL 的 SHB-SAPN 添加到一次性比色皿中，并通过单击绿色箭头运行软件。选择读出的百分比音量。 纳米粒子跟踪分析 在重新折叠的缓冲区中稀释样品 1：20。制作 10 mL 的稀释样品。 使用 3 mL 注射器，用重新折叠缓冲液冲洗 NTA 仪器，并加载约 1.5 mL 的样品以平衡仪器。使用示例的其余部分进行分析。 单击SOP选项卡在 NTA 软件中创建新的 SOP。在选项卡下，将捕获次数更改为 3，并将捕获时间更改为 30 s。 按下屏幕左侧的自动对焦按钮，使示例进入焦点。使用机器侧面的手动对焦旋钮微调对焦。 当系统提示使用注射器加载少量样品时，运行创建的 SOP。系统获取所有捕获后，将自动打开分析屏幕。滑动检测限制栏，以便所有真实粒子都标有红色十字标记。按下运行分析按钮，分析将自动开始。 传输电子显微镜 （TEM） 发光放电形态/碳 400 网状铜 TEM 支撑膜。 以0.075mg/mL浓度向网格添加3μL样品，使用滤纸将液体从液体中除掉30s。 用3 μL的去离子水清洗电网三次，每次用滤纸把水吸出。 在支撑膜中加入3 μL的0.5%酸酯，让它坐30s. Wick关闭大部分醋酸尿酸酯，但在水面上留下一层薄膜。在传输电子显微镜上成像之前，让样品干燥。 在 TEM 上以 80 kV 的成像样本。 8. 使用动力学脂质溶酶（LAL）测定样品中内毒素水平的测定 从冰箱中取出套件和样品，以便与 RT 平衡。 为了执行此测定，需要具有热块的板读取器，并且能够在 37°C 下以 405 nm 的波长读取 40 个读数的样本。编写程序模板，以便每 150 s 读取一口井以识别开始时间点（与第一次读取相比，OD 增加了 0.2）。 将样品稀释至PBS中的免疫剂量浓度。注： 重新折叠缓冲液的 pH 超出 LAL 测定范围。PBS 中样品的稀释会将 pH 设置为可接受的范围。 根据分析证书确定，在适当的无内毒素 LAL 水中重新悬浮控制内毒素，以生成 50 EU/mL。大力涡旋小瓶15分钟，以确保内毒素完全重新悬浮。 通过在 50 EU 至 0.005 EU/mL 范围内的玻璃瓶中预成型 10 倍的连续稀释，生成内毒素标准曲线。对于每次稀释，将先前稀释的 0.1 mL 添加到 0.9 mL 的 LAL 水。组合后大力涡旋1分钟。 将标准曲线稀释和 SHB-SAPN 样品重复添加到 96 孔板中。在重复中使用 LAL 水作为负控制。在37°C下预育板15分钟。 在孵育结束时，用2.6 mL的LAL水重新悬浮测定试剂瓶。用血清学移液器轻轻混合内容。 在 96 孔板的每个孔中加入 100 μL 的测定试剂。快速将板移到板读取器，并运行步骤 8.2 中编写的程序模板。 程序完成后，使用控件的日志值与开始时间的日志值生成标准曲线。使用此曲线生成的公式计算样品中的内毒素浓度。