Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

1. expressie van het SHB-SAPN-eiwit in E. coli BL21 (DE3) Meng 95 mL van deel A en 5 mL van de media in een steriel glazen erlenmeyer kolf van 2 L volgens de instructies van de fabrikant (Zie de tabel met materialen). Voeg ampicileen toe tot een eindconcentratie van 100 μg/mL. Inoculeren van de media met E. coli van een eerder gevestigde glycerol stam cultuur. Incubate cultuur bij 30 °C met schudden bij 200 rotaties per minuut (rpm) voor 48 h.Opmerking: de gebruikte E. coli BL21 (DE3) voorraad bevatte de ampicillaire resistente expressie Vector23 met het SHB-SAPN-gen. Hoewel het algemene Protocol van de media raadt 24 h van incubatie bij 37 ° c, 48 h van incubatie bij 30 ° c gaf een hogere opbrengst voor SHB-SAPN. Breng de cultuur over naar 2 50 mL conische buizen. Centrifugeer de buizen op 4.000 x g gedurende 10 minuten met een vaste hoekrotor bij 4 °c. Verwijder het supernatant en bewaar de pellet om cellen te oogsten.Opmerking: de celpellet kan worden verwerkt onmiddellijk of bevroren bij-80 °C tot gebruik. 2. Lysis van E. coli BL21 (DE3) door sonicatie Opmerking: gebruik niet-pyrogeen plasticware en glaswerk dat op 250 °c wordt gebakken gedurende ten minste 30 min. tris (2-carboxyethyl) Fosfine (tcep) als reduceermiddel breekt de bisulfide bindingen binnen en tussen eiwitten. TCEP is nodig in de buffers tijdens dit protocol als het weergegeven antigeen S-S-obligaties bevat. Alleen voor SHB-SAPN Core is de aanwezigheid van TCEP in de buffers niet essentieel. Bereid imidazol-vrije buffer (8 M ureum, 50 mM natriumfosfaat monobasic, 20 mM tris-basis, 5 mM TCEP) pH 8,0 (aangepast met 5 N NaOH) en filtreer deze met een vacuüm fles filter Unit van 0,22 μm. Respendeer de cellen van de gepileerde (uit stap 1,3) met 40 ml imidazol-vrije buffer in een conische buis van 1 50 ml. Sonicate de geresuspendeerde cellen met een sonde op ijs gedurende 5 minuten (4 s van sonicatie, 6 s van rust) met een ultrasoonapparaatuitvoer van 150 W. Centrifugeer het cellulaire lysaat (40 mL) bij 29.000 x g bij 4 °c gedurende 25 minuten in een vaste hoekrotor om een opgehelderd supernatant te genereren. Breng de supernatant over in een steriele kolf van 150 mL en gooi de pellet weg. Verdun de supernatant tot 100 mL met behulp van de imidazol-vrije buffer (later in het protocol “sample” genoemd).Opmerking: deze verdunningsstap is nodig om te voorkomen dat de fplc-systeemdruk te hoog wordt tijdens het laden van lysaat op de kolom. 3. eiwit zuivering met behulp van een his-column Opmerking: dit protocol werd uitgevoerd met behulp van een FPLC-instrument, maar het kan worden aangepast aan de zwaartekracht stroom. Bereid de volgende buffers voor en filtreer ze met een 0,22 μm vacuüm fles filtratie-eenheid: (i) imidazol-vrije buffer “buffer A” (8 M ureum, 50 mM natriumfosfaat monobasic, 20 mM tris-basis, 5 mM TCEP) pH 8,0; II) 500 mM imidazol-buffer “buffer B” (8 M ureum, 50 mM natriumfosfaat monobasis, 20 mM tris-basis, 5 mM TCEP, 500 mM imidazol) pH 8,0; en (III) het wassen van isopropanol (20 mM Tris, 60% isopropanol) pH 8,0.Opmerking: de pH voor elke buffer is aangepast met 5 N NaOH. Zijn kolom.Opmerking: voor productie op labschaal gebruikt dit protocol een 5 mL voorverpakte zijn kolom, maar een grotere kolom kan worden gebruikt. Open de FPLC-software en klik op de optie nieuwe methode . Het wordt onmiddellijk geopend in het menu methode-instellingen . Kies C1-poort 3onder het dropdownmenu voor de kolom positie. Op de getoonde door techniek drop-down menu kies affiniteit. In het dropdown-menu kolom Type kiest u anderen, histrap HP, 5 ml. Het kolom volume en de druk dozen worden automatisch ingesteld op de juiste waarden. Klik op de knop methode omtrek . Sleep de volgende knoppen in het popup-menu van de fase bibliotheek : equilibratie, voorbeeldtoepassing, kolom spoelingen elutie naast de pijl in die exacte volgorde. Sluit het menu van de fase bibliotheek . Klik op de equilibratietijd -knop. De in de tabel vermelde waarden moeten “initiële buffer B” (4%), “eind buffer B” (4%) en “volume (CV)” 5 zijn. Klik op het vak voorbeeldtoepassing . Klik in het vak voor het laden van het monster op het keuzerondje voor het injecteren van monster op kolom met monsterpomp. Zorg ervoor dat het vakje naast het gebruik debiet van de methode-instellingen wordt gecontroleerd in de monster injectie met systeem pomp doos. Verander de waarde naar 20 mlnaast het volumevak aan de rechterkant van het scherm. Klik op de knop voor het wassen van de kolom . De in de tabel vermelde waarden moeten “initiële buffer B” (4%), “eind buffer B” (4%) en “volume (CV)” 5 zijn. Klik naast het breuk verzamelings schema op het vak inschakelen. Klik op de knop elutie . De waarden die in de tabel worden vermeld, moeten “initiële buffer B” 0%, “uiteindelijke buffer B” 100% en “volume (CV)” 5 zijn. Klik naast het breuk opvangschema op het vakje inschakelen . Klik op de gewenste breuk grootte van methode-instellingen en pas de Fractie grootte aan op 4 ml in het invulveld hieronder. Klik op de knop Opslaan als boven aan de software. Noem het bestand “equilibration”. Sluit een voorverpakte 5 mL-kolom aan op de corresponderende kolom poort 3 op de FPLC. Zowel pomp A-als pomp B-buizen en de monsterpomp slang moeten in 0,22 μm gefilterd gedeïoniseerd water worden geplaatst. Voer het equilibratietijd-programma uit. Plaats zowel de pomp a en de pomp B als de monsterpomp slang in de imidazol-vrije buffer (buffer A) en voer het equilibratietijd protocol opnieuw uit. Bind het monster aan de kolom en reinig het eiwit.Open de FPLC-software en klik op de optie nieuwe methode . Het wordt onmiddellijk geopend in het menu methode-instellingen . Kies C1-poort 3onder het dropdownmenu voor de kolom positie . Op de getoonde door techniek drop-down menu kies affiniteit. In het dropdown-menu kolom Type kiest u anderen, Histrap HP, 5 ml. Het kolom volume en de druk dozen worden automatisch ingesteld op de juiste waarden. Klik op de knop methode omtrek . Sleep de knoppen van het popup-menu van de Phase Library : equilibratie, monster toepassing, kolom spoeling (Wash 1), kolom Wash (Wash 2), kolom Wash (Wash 3) en elution naast de pijl in dat exacte volgorde. Sluit het menu van de fase bibliotheek . Klik op de Equilibration -knop. De in de tabel vermelde waarden moeten “initiële buffer B” 4%, “eind buffer B” 4% en “volume (CV)” 5 zijn. Klik op het vak voorbeeldtoepassing . Klik in het vak voor het laden van het voorbeeld op het keuzerondje voor Inject-monster op kolom met monsterpomp. Zorg ervoor dat het vakje naast het gebruik debiet van de methode-instellingen wordt gecontroleerd in de monster injectie met systeem pomp doos. Wijzig de waarde naar 100 mL naast het volumevak aan de rechterkant van het scherm. Klik naast het schema voor het verzamelen van breuken op de knop inschakelen . Klik op het vak gebruik fractie grootte van methode-instellingen en wijzig vervolgens de Fractie grootte in 4 ml. Klik op de eerste kolom Wash knop (Wash 1). De in de tabel vermelde waarden moeten “initiële buffer B” 4%, “eind buffer B” 4% en “volume (CV)” 10 zijn. Klik naast het schema voor het verzamelen van breuken op het vak inschakelen . Klik op de gewenste breuk grootte van methode-instellingen en wijzig de Fractie grootte in 4 ml. Klik op de tweede kolom Wash knop (Wash 2). De in de tabel vermelde waarden moeten “initiële buffer B” 0%, “eind buffer B” 0% en “volume (CV)” 5 zijn. Klik naast het schema voor het verzamelen van breuken op het vak inschakelen . Klik op de gewenste breuk grootte van methode-instellingen en wijzig de Fractie grootte in 4 ml. Klik op de derde kolom Wash knop (Wash 3). De in de tabel vermelde waarden moeten “initiële buffer B” 0%, “eind buffer B” 0% en “volume (CV)” 5 zijn. Klik naast het schema voor het verzamelen van breuken op inschakelen. Klik op het vak gebruik fractie grootte van methode-instellingen en wijzig vervolgens de Fractie grootte in 4 ml. Klik op de knop elution . Klik in de tabel met de rechtermuisknop op de vermelde informatie en klik in het menu dat wordt weergegeven op stap verwijderen. Sleep de isocratische verloop knop tweemaal naar de tabel, zodat er twee ingangen zijn. De waarde voor de eerste vermelding moet “initiële buffer B” 30%, “eind buffer B” 30% en “volume (CV)” 10 lezen. De waarde voor de tweede vermelding moet “initiële buffer B” 100%, “uiteindelijke buffer B” 100% en “volume (CV)” 10 lezen. Klik naast het schema voor het verzamelen van breuken op de knop inschakelen . Klik op het vakje naast gebruik fractie grootte van methode-instellingen. Klik op de knop Opslaan als boven aan de software. Noem het bestand “zuivering”. Pomp een slang van de fplc moet in de imidazool-vrije wasbuffer worden geplaatst, terwijl de pomp B-slang in de 500 mm imidazol-buffer moet worden geplaatst. De monsterpomp slang moet in het 100 mL monster worden geplaatst. Voer het programma “zuivering” uit en wacht op de tijd dat de 60% isopropanol nodig is (Wash 2). Pauzeer het programma, verplaats pomp een slang van de imidazole-vrije Wash in de 60% isopropanol Wash. Start het programma opnieuw. Zodra de isopropanol stap is voltooid, onderbreekt u het programma opnieuw en verplaatst u de pomp een slang terug in de imidazol-vrije wasbuffer. Start het zuiverings programma opnieuw op (de rest van de uitvoering is geautomatiseerd). 4. zuiverheids beoordeling en eiwit identificatie door SDS-PAGE Combineer alle fracties die corresponderen met (i) doorstroom (het cellysaat dat niet aan de zijn kolom bindt), (II) was 1, (III) was 3 (60% isopropanol Wash) en (IV) was 3 in aparte 50 mL conische buizen. Combineer de 2 mL fracties niet uit de elutie stappen. Meng 15 μL van elk van de samengevoegde fracties en alle fracties uit elutie stappen met 2x Laemmli monster buffer in een 0,5 mL micro centrifugebuis en denatureren ze gedurende 10 minuten bij 95 °C. Stel, terwijl de proteïne denatuur is, het gel-hardloop apparaat in met 3 vlek vrije 4 – 20% prefab polyacrylamidegels in 1x tris-Glycine SDS-PAGE Running buffer. Plaats 8 μL moleculair gewichts markering op de eerste put en 30 μL gedenatureerde monster naar de andere putjes van de gel. Voer de gels uit op 200 V totdat de kleurstof voorzijde de bodem van de gel raakt (ongeveer 30 min). Verwijder de gels uit het apparaat en spoel kort met gedeïoniseerd water. Afbeelding van de gel onmiddellijk met behulp van het vlek vrije beeld systeem. Identificeer de fracties die eiwit banden bevatten met de juiste maat (18,07 kDa). Pool al deze fracties. 5. eiwit identificatie door Western Blot Voer een Western-Blot uit met behulp van een his-specifiek antilichaam (anti-6x HisTag) en een SHB-specifiek antilichaam (167-D-IV) om het gezuiverde volledige eiwit te legitimeren. De anti-6x HisTag-antilichaam herkent het N eindpunt van het eiwit en het 167-D-IV-antilichaam herkent het C-eindpunt dat de aanwezigheid van het volledige eiwit aantoont. Bepaal de eiwitconcentratie van de (i) doorstroom, (II) Wash 1, (III) Wash 2 (60% isopropanol Wash), (IV) Wash 3 en alle fracties van de elutie stappen met het spectrometer-instrument bij een absorptie van 280 nm. Genereer verdunningen die 100 ng eiwit bevatten in 15 μL imidazol-vrije buffer voor elk van deze groepen. Voeg 15 μL 2x Laemmli-monster buffer toe aan elke 15 μL van de monsters en denatureren ze zoals in stap 4,1. Zodra de denaturering is voltooid, draai de buizen om ervoor te zorgen dat alle eiwitten kunnen worden overgebracht. Laad monsters en de voorgebeitste marker in een vlek vrije 4 – 20% voorgesneden polyacrylamidegel. Voer de elektroforese op 200 V totdat het kleurstof front de bodem van de gel bereikt. Maak, terwijl de gel loopt, 1 L TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl en 0,1% Tween 20) en 200 mL 5% niet-vette melk in TBS-T. Gebruik een transfersysteem van Western Blot om eiwitten over te brengen naar een nitrocellulose membraan. Gebruik een voorgemonteerde Transfer stack en plaats de gel erop. Stel het systeem in op 25 V gedurende 7 min. Controleer op de aanwezigheid van de voorbevlekt marker op het nitrocellulose membraan dat een volledige overbrenging aangeeft.Opmerking: alle volgende stappen worden uitgevoerd op een orbitale shaker set bij 100 RPM bij kamertemperatuur (RT). Zodra de overdracht is voltooid, wassen blots twee keer met TBS-T voor 10 min elk. Blokkeer de nitrocellulose membranen (Blot) met 5% niet-vette melk in TBS-T gedurende ten minste 1 uur. wassen blots twee keer met TBS-T voor 10 min elk. Verdun de primaire 167-D-IV en anti-6x HisTag antilichamen tot 1 mg/mL in TBS-T (Stock AB). Verdun de voorraad ABS van de 167-D-IV 10.000-fold en de anti-6x HisTag 5.000-fold door toevoeging van 2 μL van de voorraad 167-D-IV en 4 μL van de voorraad anti-6x HisTag antilichamen tegen twee verschillende buisjes met 20 mL TBS-T. Voeg het totale volume van de primaire antilichamen van 20 mL, één voor elke vlek, toe en incuberen de blots gedurende 1 uur. was tweemaal met TBS-T gedurende 10 min. Verdun 4 μL van 1 mg/mL van het anti-menselijke secundaire antilichaam van de muis, geconjugeerd met alkalische fosfatase in 20 mL TBS-T (1:5000 verdunning). Verdun 4 μL van 1 mg/mL van het secundaire anti-muis antilichaam van de geit, geconjugeerd met alkalische fosfatase in 20 mL TBS-T (1:5000 verdunning). Voeg secundaire antilichamen toe aan de bijbehorende blots.Opmerking: het anti-humane secundaire antilichaam bindt aan 167-D en de anti-muis bindt aan de anti-6x HisTag. Wassen blots twee keer met TBS-T voor 10 min. Voeg voldoende BCIP/NBT alkalische fosfatase substraat om de blots te bedekken. Ontwikkel de blots voor ongeveer 10 minuten tot de bands verschijnen. Spoel de blots af met koud kraanwater en laat ze drogen voordat u scant met een flatbedscanner. 6. de SHB-SAPN opnieuw vouwen Voeg het samengevoegde eiwit (10 \ u201220 mL totaal) toe aan een 10 kDa molecuulgewicht cut-off dialyse cassette en dialyseer het in 8 M ureum, 20 mM Tris, 5% glycerol, 5 mM TCEP pH 8,5 bij RT (18 \ u201226 °C) ‘s nachts. Het ureum langzaam van het monster te voorzien door de ureum concentratie in de dialyse buffer stapsgewijs met 2 M om de 2 uur te verlagen. Bij een ureum concentratie van 2 M, verplaats het dialyse apparaat naar 4 °C (gebruik TCEP niet in de dialyse buffer uit deze stap). Voltooi het hervouwen door het monster te dialyseren in 120 mM ureum, 20 mM Tris, 5% glycerol, pH 8,5 bij 4 °C ‘s nachts. Verwijder het refolded proteïne (SHB-SAPN) uit de dialyse cassette. Filtreer de SHB-SAPN met een 0,22 μm Polyvinylideenfluoride (PVDF) spuit filer. Aliquot SHB-SAPN in steriele buizen en bevries ze bij-80 °C, waarbij ten minste 100 μL bij RT wordt gehouden voor latere analyses. 7. validering van deeltjes naar grootte en uiterlijk Dynamische lichtverstrooiing (DLS) Meet de gemiddelde deeltjesgrootte van de SHB-SAPN door de volgende parameters: Selecteer eiwitten als materiaal, creëer een complexe buffer voor 120 mM ureum, 20 mM Tris, 5% glycerol 25 °C voor temperatuur, selecteer wegwerp cuvetten voor de analyse, selecteer automatisch meting, ingesteld voor 5 runs. Voeg 45 μL SHB-SAPN toe aan een wegwerp-cuvette en voer de software uit door op de groene pijl te klikken. Selecteer het percentage volume voor de uitlezen. Nanoparticle-traceer analyse (NTA) Verdun het monster met 1:20 in de hervouwende buffer. Maak 10 mL verdund monster. Spoel met behulp van 3 mL spuiten het NTA-instrument met de buffer opnieuw in en laad ongeveer 1,5 mL van het monster om het instrument te equilibreren. Gebruik rest van het voorbeeld voor de analyse. Maak een nieuwe SOP in de NTA-software door op het SOP -tabblad te klikken. Wijzig onder het tabblad het aantal opnamen in 3 en wijzig de opnametijd in 30 sec. Druk op de autofocus -knop aan de linkerkant van het scherm om het monster scherp te stellen. Gebruik de handmatige scherpstel knop aan de zijkant van het apparaat om de scherpstelling te verfijnen. Voer de gecreëerde SOP, wanneer het systeem vraagt laadt een klein volume van het monster met de spuit. Nadat het systeem alle opnames heeft gemaakt zal het automatisch het analyse scherm naar boven brengen. Schuif de detectie grensbalk zodanig dat alle echte deeltjes zijn gemarkeerd met rode kruisen. Druk op de knop analyse uitvoeren en de analyse wordt automatisch gestart. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) Gloeien afvoer formvar/Carbon 400 mesh koper TEM ondersteuning van films. Voeg 3 μL monster bij een concentratie van 0,075 mg/mL toe aan het rooster voor 30 sec. met een filtreerpapier van de vloeistof af. Was driemaal het rooster met 3 μL gedeïoniseerd water, elke keer dat het water met filtreerpapier afwicking. Voeg 3 μL van 0,5% ammoniumuranylcarbonaat acetaat toe aan de ondersteunende folie en laat het 30 sec. de meeste ammoniumuranylcarbonaat acetaat afstaan, maar laat een dunne film achter op het oppervlak. Laat de monsters drogen voordat ze worden teruggezet op de transmissie elektronen microscoop. Beeld monsters bij 80 kV op een TEM. 8. bepaling van het endotoxinegehalte in de monsters met behulp van een kinetische Limulus amoebocyte lysaat (LAL) test Verwijder de kit en de monsters uit de koelkast en laat de RT op een evenwichts veld. Om deze test uit te voeren, is een plaat lezer met een warmte blok en de mogelijkheid om de monsters voor 40 te lezen bij een golflengte van 405 Nm bij 37 °C vereist. Schrijf een programmasjabloon zodat putten elke 150 s worden gelezen om het begintijd punt te identificeren (de OD steeg met 0,2 in vergelijking met de eerste Lees). Verdun het monster tot de concentratie van de immunisatie dosis in PBS.NB: de pH van de refolding buffer valt buiten het bereik van de LAL assay. De verdunning van het monster in PBS zal de pH op het acceptabele bereik zetten. Regenereert de controle Endotoxine in de juiste hoeveelheid endotoxine vrij LAL water zoals bepaald door het analysecertificaat om 50 EU/mL te genereren. Draai de injectieflacon krachtig gedurende 15 minuten om de volledige resuspensie van het endotoxine te garanderen. Genereer de endotoxine standaard curve door voor vorming van een 10-voudige seriële verdunning in glazen flesjes in het bereik van 50 EU tot 0,005 EU/mL. Voeg voor elke verdunning 0,1 mL van de vorige verdunning toe aan 0,9 mL LAL water. Vortex krachtig na combinatie gedurende 1 minuut. Voeg een standaard curve verdunningen en SHB-SAPN monsters in tweevoud toe aan een 96-well plate. Gebruik LAL water als een negatieve controle in duplicaat ook. Pre-incuberen de plaat bij 37 °C gedurende 15 minuten. Tegen het einde van de incubatie, respendeert u de injectieflacon met test reagens met 2,6 mL LAL water. Meng inhoud voorzichtig met een serologische pipet. Voeg 100 μL van het test reagens toe aan elk goed van de 96-goed plaat. Verplaats de plaat snel naar de plaat lezer en voer de programmasjabloon uit die is geschreven in stap 8,2. Nadat het programma is voltooid, genereert u een standaard curve met de logboek waarde van de besturingselementen versus de logboek waarde van de begintijd. Gebruik de formule die uit deze curve wordt gegenereerd om de endotoxine concentratie in de monsters te berekenen.