En detaljert metode er gitt her beskriver rensing, refolding, og karakterisering av selv-montering protein nanopartikler (SAPNs) for bruk i vaksine utvikling.
Selv montering av protein nanopartikler (SAPNs) fungerer som repeterende antigen-skjermer og kan brukes til å utvikle et bredt spekter av vaksiner for ulike infeksjonssykdommer. I denne artikkelen viser vi en metode for å produsere en SAPN kjerne inneholder en seks-Helix Bundle (SHB) forsamling som er i stand til å presentere antigener i en trimeric konformasjon. Vi beskriver uttrykket av SHB-SAPN i et E. coli -system, i tillegg til de nødvendige trinnene for protein rensing. Vi inkluderte en isopropanol vasketrinn for å redusere den gjenværende bakterielle lipopolysakkarid. Som en indikasjon på protein identitet og renhet, reagerte proteinet med kjente monoklonale antistoffer i Western Blot-analyser. Etter refolding falt størrelsen på partiklene i det forventede området (20 til 100 NM), som ble bekreftet av dynamisk lysspredning, nanopartikkel sporings analyse og overføring av elektron mikroskopi. Metodikken som beskrives her, er optimalisert for SHB-SAPN, men med bare små endringer kan den brukes på andre SAPN-konstruksjoner. Denne metoden er også lett overførbar til Storskalaproduksjon for GMP produksjon for menneskelige vaksiner.
Mens tradisjonell vaksine utvikling har fokusert på inaktive eller svekkede patogener, har fokus for moderne vaksiner forskjøvet mot delenhet vaksiner1. Denne tilnærmingen kan føre til en mer målrettet respons, og potensielt mer effektiv vaksine kandidater. Men en av de viktigste ulempene er at delenhet vaksiner er ikke partikler som hele organismer som kan resultere i redusert immunogenisitet2. En nanopartikkel som et repeterende antigen display system kan ha fordelene av både målrettede delenhet vaksine tilnærming samt partikler natur hele organismen1,3.
Blant de eksisterende typer Nanovaccines, rasjonelt utformet protein forsamlinger tillate design og utvikling av vaksine kandidater som kan presentere flere eksemplarer av antigen potensielt i en innfødt-lignende konformasjon1,4 ,5,6. Et eksempel på disse protein forsamlinger er selv-sammenstillingen protein nanopartikler (SAPNs)7. SAPNs er basert på spiral-coil domener og er tradisjonelt uttrykt i Escherichia coli8. SAPN vaksine kandidater har blitt utviklet for en rekke sykdommer som malaria, Sars, influensa, toxoplasmosis og HIV-19,10,11,12,13 , 14 priser og priser , 15 priser og , 16 flere , 17 i , 18 av år , 19. utformingen av hver SAPN kandidat er spesifikk for patogen av interesse, men produksjonen, rensing, og refolding teknikker er generelt bredt aktuelt.
En av våre nåværende interesser er en effektiv HIV-1-vaksine. I RV144 — den eneste fase III kliniske studien av en HIV-1-vaksine som viste beskjeden effekt – den reduserte risikoen for infeksjon var korrelert med IgG antistoffer mot V1V2-løkken i konvolutt proteinet20,21. Den innfødte-lignende trimeric presentasjon av denne regionen antas å være viktig for beskyttende immunogenisitet22. Å presentere V1V2 sløyfe i så nær native-like konformasjon som mulig, vi utviklet et bevis på prinsippet SAPN vaksine kandidat som inneholdt HIV-1 konvolutt etter fusjon seks-Helix Bundle (SHB) å presentere V1V2 sløyfe i riktig konformasjon9 . Denne kandidaten ble anerkjent av kjente monoklonale antistoffer mot HIV-1 konvolutt protein. Mus vaksineres med V1V2-SHB-SAPN hevet V1V2 spesifikke antistoffer, som, viktigst, bundet til gp70 V1V2, riktig conformational epitopes9. Den SHB-SAPN kjernen kunne ha andre funksjoner utover rollen som en operatør for HIV-1 V1V2 loop. Her beskriver vi en detaljert metodikk for uttrykk, rensing, refolding og validering av SHB-SAPN kjerne. Sekvensen utvalg, nanopartikkel design, den molekylære kloning, og transformasjon av E. coli har tidligere blitt beskrevet9.
Nanoteknologi gir mange fordeler og løsninger for delenhet vaksine utvikling. Nanovaccines kan gjentatte ganger presentere antigener som partikler til verts immunsystemet øker immunogenisitet26. Mens det er mange forskjellige typer Nanovaccines, tror vi at de består av de Novo designet protein synes å være den sterkeste tilnærmingen for vaksine utvikling1. De kan være konstruert uten noen sekvens homologi til verten proteiner og presentere antigen av interesse i nær native-like konformasjon samtidig som lave produksjonskostnader og høy produkt avkastning. Et godt eksempel på denne tilnærmingen er SAPN teknologi, som vi har søkt på vaksiner mot flere smittsomme sykdommer7. Adressering vanskelighetene i HIV-1 vaksine utvikling, har vi utviklet en unik SHB-SAPN kjerne for effektivt å presentere V1V2 antigen i en innfødt-lignende trimeric konformasjon9. Mange vaksine mål, spesielt for virussykdommer, er tilstede som trimers27. Dette fenomenet indikerer at vår SAPN design har bred implikasjoner for utviklingen av delenhet vaksiner.
I denne metoden demonstrerer vi hvordan man produserer SHB-SAPNs i et E. coli Expression system. Vi uttrykte høye avlinger av protein (ca 6 mg/100 mL kultur). Proteinet inneholdt 10 histidines og ble lett renset ved hjelp av en immobilisert metall affinitet kromatografi med ni2 + kolonne. Denne lengden av HIS-tag ble funnet å være den optimale for den høyeste protein yield. Renset proteinet inneholdt full lengde av designet protein som indikert av tilstedeværelsen av både N-Terminal HisTag og C-terminalen heptad gjenta. Vi benyttet allment aksepterte teknikker og optimalisert dem for uttrykk, produksjon og karakterisering av SHB-SAPN kjernen. Mangel på produksjon av full-lengde protein under utviklingen av en SAPN inneholder et nytt protein epitope kan indikere et uttrykk problem av genet i verten cellen. Hvis det skjer, må genet og uttrykks systemet være redesignet og tilpasset den beskrevne protokollen. Modifisering av sonikering tid eller intensitet kan også øke konsentrasjonen av spådd full-lengde protein.
Ombrettes partikler var i forventet størrelsesområde (20 til 100 NM)8,24,25 som bestemmes av DLS og nanopartikkel Tracking analyse. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av TEM. Hvis det er problemer i dette trinnet, er det normalt på grunn av et problem med pH eller ioniske styrke refolding buffer. Når stor størrelse partikler oppdages på partikkel dimensjonering teknikker, indikerer det aggregering, som kan unngås ved å øke pH i refolding buffer. Hvis partiklene ikke oppdages av DLS, verifisere konsentrasjonen av proteinet og sjekk pH i bufferen. Den endelige protein konsentrasjonen for DLS bør være minst 100 μg/mL. Hvis konsentrasjonen er ikke problemet, indikerer det overflod av små, ufullstendig dannet partikler, hvis konsentrasjonen kan reduseres ved å redusere pH. Alternativt kan natriumklorid konsentrasjonen justeres til det optimale området for å minimere tilstedeværelsen av partikler med uønsket størrelse.
Til slutt, ved hjelp av en isopropanol vasketrinn under rensing vi var i stand til å redusere forurensende LPS fra verten E. coli til 0,01 EU/ΜG av SAPN som er under Food and Drug ADMINISTRATION (FDA) grense på 5 EU/kg kroppsvekt for injiserbare produkter 28. dette nivået kan bli ytterligere redusert ved å bruke en anion utvekslings Kol onnen også kjent som Q kolonne. Hvis høye nivåer av endotoksin er fortsatt til stede, sjekk alle materialer som ble brukt for buffer forberedelse. Husk å bruke bare depyrogenated glass og endotoksin gratis plasticware i denne metoden.
Disse resultatene tyder på at vi har med hell utviklet en metode for å produsere SHB-SAPN kjernen som kan brukes for pre-kliniske immunisering studier. Denne metoden med bare små modifikasjoner, om noen, kan brukes til rensing av SHB-SAPNs når et antigen av interesse er lagt til. Ved hjelp av denne metoden som utgangspunkt en av de store endringene er i eluering trinn. Ulike proteiner eluere ved ulike imidazole konsentrasjoner som må fastsettes eksperimentelt. Den andre store forskjellen kan være sammensetningen av refolding buffer. Optimalisering vil kreve testing ulike pH forhold samt ioniske styrker.
I betraktning av fremtidig arbeid, er det bare to små modifikasjoner som trengs for å tillate menneskelig anvendelse av SHB-SAPN. Den første er at uttrykket vektoren må endres til en kanamycin motstand valgbar markør på grunn av Ampicillin allergi hos mennesker29. Det annet større behov av det protein fremstiller for Human bruk er å tilvirke det SHB-SAPN inne dyr fabrikat-ledig Media. En liten studie indikerte allerede en rimelig utbytte av protein i en plantebasert Media. Arbeidet som presenteres her er lett skalerbar for endelig GMP produksjon som demonstrert med en malaria vaksine kandidat, FMP01416. Denne stor skala FMP014-SAPN-produksjonen inkluderte både den anion utvekslingen og de avgjørende utvekslings trinnene for å redusere LPS og ni2 + innhold fra det endelige produktet. Dette bakteriell-uttrykt SAPN er allerede skalert opp for en kommende fase 1/2a klinisk studie.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en samarbeidsavtale (W81XWH-11-2-0174) mellom Henry M Jackson Foundation for fremming av militær medisin, Inc. og det amerikanske forsvarsdepartement. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV antistoff ble mottatt fra Dr. Susan Zolla-Pazner gjennom NIH AIDS reagens program.
10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |