एक विस्तृत विधि यहाँ टीका विकास में उपयोग के लिए आत्म इकट्ठा प्रोटीन नैनोकणों (SAPNs) के शुद्धि, refolding, और विशेषता का वर्णन प्रदान की जाती है।
स्व-एसेंबलिंग प्रोटीन नैनोकणों (SAPNs) दोहराए एंटीजन प्रदर्शित करता है के रूप में कार्य और विभिन्न संक्रामक रोगों के लिए टीकों की एक विस्तृत श्रृंखला विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस लेख में हम एक छह-हेलिक्स बंडल (SHB) विधानसभा है कि एक trimeric conformation में प्रतिजनों को पेश करने में सक्षम है युक्त एक SAPN कोर का उत्पादन करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन. हम एक ई. कोलाई प्रणाली में SHB-SAPN की अभिव्यक्ति का वर्णन है, साथ ही आवश्यक प्रोटीन शुद्धि कदम. हम अवशिष्ट जीवाणु lipopolysaccharide को कम करने के लिए एक आइसोप्रोपेनोल धोने कदम शामिल थे। प्रोटीन पहचान और शुद्धता का एक संकेत के रूप में, प्रोटीन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में ज्ञात monoclonal एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की. refolding के बाद, कणों का आकार अपेक्षित रेंज में गिर गया (20 से 100 एनएम), जो गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन, नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण, और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई थी। यहाँ वर्णित पद्धति SHB-SAPN के लिए अनुकूलित है, हालांकि, केवल मामूली संशोधनों के साथ यह अन्य SAPN constructs पर लागू किया जा सकता है। इस विधि को भी आसानी से मानव टीकों के लिए जीएमपी विनिर्माण के लिए बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए हस्तांतरणीय है.
जबकि पारंपरिक वैक्सीन विकास निष्क्रिय या क्षीण रोगजनकों पर ध्यान केंद्रित किया है, आधुनिक टीकों का ध्यान सबयूनिट टीकों1की ओर स्थानांतरित कर दिया गया है। इस दृष्टिकोण एक और अधिक लक्षित प्रतिक्रिया करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और संभावित रूप से अधिक प्रभावशाली टीका उम्मीदवारों. तथापि, मुख्य कमियों में से एक यह है कि सबयूनिट टीके पूरे जीवों की तरह कण नहीं होते हैं जिसके परिणामस्वरूप इम्यूनोजेनिकिटी2कम हो सकती है। दोहराव वाले प्रतिजन प्रदर्शन प्रणाली के रूप में एक नैनोकण में लक्षित सबयूनिट वैक्सीन दृष्टिकोण के साथ – साथ पूरे जीव की कणिक प्रकृति1,3दोनों के लाभ हो सकते हैं .
Nanovaccines के मौजूदा प्रकार के अलावा, तर्कसंगत रूप से डिजाइन प्रोटीन विधानसभाओं डिजाइन और टीका उम्मीदवारों के विकास के लिए अनुमति देते हैं कि एक देशी की तरह रचना1,4 में संभावित प्रतिजन के कई प्रतियां पेश कर सकते हैं ,5,6. इन प्रोटीन विधानसभाओं का एक उदाहरण स्व-समुच्चय प्रोटीन नैनोकणों (एसएएन)7हैं। SAPNs coiled-coil डोमेन पर आधारित हैं और पारंपरिक रूप से Escherichia कोलाई8में व्यक्त कर रहे हैं. एसएपीएन वैक्सीन उम्मीदवारों को मलेरिया, सार्स, इन्फ्लूएंजा, टोक्सोपलोसिस, और एचआईवी-1 9,10,11,12,13 जैसे विभिन्न रोगों के लिए विकसित किया गया है , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. प्रत्येक एसएपिन उम्मीदवार का डिजाइन ब्याज के रोगज़नक़ के लिए विशिष्ट है, तथापि, उत्पादन, शोधन, और refolding तकनीक आम तौर पर मोटे तौर पर लागू होते हैं.
हमारे वर्तमान हितों में से एक एक प्रभावी एचआईवी-1 टीका है. RV144 में – एक एचआईवी-1 टीके का एकमात्र चरण III नैदानिक परीक्षण जो मामूली प्रभावकारिता का प्रदर्शन करता था-संक्रमण का कम जोखिम लिफाफा प्रोटीन20,21के V1V2 लूप से आईजीजी एंटीबॉडी के साथ संबंधित था . इस क्षेत्र की देशी-समान त्रिमकी प्रस्तुति को सुरक्षात्मक इम्यूनोजेनिकता22के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है। संभव के रूप में देशी की तरह रचना के करीब के रूप में V1V2 पाश पेश करने के लिए, हम सिद्धांत SAPN टीका उम्मीदवार है कि एचआईवी-1 लिफाफा पोस्ट-फ्यूजन छह-हेलिक्स बंडल (SHB) शामिल का एक सबूत विकसित करने के लिए सही अनुरूपता 9 में V1V2 पाश पेश . इस उम्मीदवार एचआईवी-1 लिफाफा प्रोटीन के लिए जाना जाता मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त किया गया था। चूहे V1V2-SHB-SAPN के साथ प्रतिरक्षित V1V2 विशिष्ट एंटीबॉडी उठाया, कि, सबसे महत्वपूर्ण बात, gp70 V1V2 के लिए बाध्य, सही conformational epitopes9. SHB-SAPN कोर एचआईवी-1 V1V2 पाश के लिए एक वाहक के रूप में भूमिका से परे अन्य कार्य हो सकता है. यहाँ हम अभिव्यक्ति, शुद्धि, refolding, और SHB-SAPN कोर के सत्यापन के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन. अनुक्रम चयन, नैनोकण डिजाइन, आणविक क्लोनिंग, और ई. कोलाई के परिवर्तन पहले9वर्णित किया गया है.
Nanotechnology subunit टीका विकास के लिए कई फायदे और समाधान प्रदान करता है. नैनोवैक्सीन बार-बार एंटीजन को मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए कण के रूप में पेश कर सकता है जो इम्यूनोजेनिकिटी26को बढ़ाता है . जबकि वहाँ नैनोटीकेक के कई अलग अलग प्रकार के होते हैं, हम मानते हैं कि डे नोवो डिजाइन प्रोटीन से बना लोगों को टीका विकास1के लिए सबसे मजबूत दृष्टिकोण लग रहे हो . वे मेजबान प्रोटीन के लिए किसी भी अनुक्रम homology के बिना इंजीनियर किया जा सकता है और कम उत्पादन लागत और उच्च उत्पाद पैदावार प्रदान करते हुए देशी की तरह रचना के करीब में ब्याज की प्रतिजन पेश करते हैं. इस दृष्टिकोण का एक प्रमुख उदाहरण SAPN प्रौद्योगिकी है, जो हम कई संक्रामक रोगों के खिलाफ टीकों के लिए आवेदन किया है7. एचआईवी-1 वैक्सीन के विकास में कठिनाइयों को संबोधित करते हुए, हमने एक अद्वितीय एसएचबी-एसएएन कोर तैयार किया है ताकि वी1वी2 प्रतिजन को देशी-जैसे ट्रिमरिक कॉन्फॉर्मेशन9में प्रभावी ढंग से पेश किया जा सके। कई टीका लक्ष्य, विशेष रूप से वायरल रोगों के लिए, trimers27के रूप में मौजूद हैं. इस घटना से पता चलता है कि हमारे SAPN डिजाइन subunit टीकों के विकास के लिए व्यापक प्रभाव पड़ता है.
इस विधि में, हम एक ई. कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली में SHB-SAPNs का उत्पादन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करते हैं। हम प्रोटीन की उच्च पैदावार व्यक्त (के बारे में 6 मिलीग्राम /100 संस्कृति के एमएल). प्रोटीन में 10 हिस्टोडिन होते थे और नी2+ कॉलम के साथ एक स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके आसानी से शुद्ध किया गया था। उनके टैग की यह लंबाई उच्चतम प्रोटीन उपज के लिए इष्टतम पाया गया. शुद्ध प्रोटीन डिजाइन प्रोटीन की पूर्ण लंबाई के रूप में दोनों एन-टर्मिनल HisTag और सी टर्मिनल heptad दोहराने की उपस्थिति से संकेत निहित. हम व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं तकनीक का उपयोग किया और उन्हें अभिव्यक्ति, उत्पादन, और SHB-SAPN कोर की विशेषता के लिए अनुकूलित. एक नया प्रोटीन एपिटोप युक्त एक SAPN के विकास के दौरान पूर्ण लंबाई प्रोटीन के उत्पादन की कमी मेजबान सेल में जीन की अभिव्यक्ति की समस्या का संकेत हो सकता है. यदि ऐसा होता है, जीन और अभिव्यक्ति प्रणाली बदल दिया और वर्णित प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. sonication समय या तीव्रता के संशोधन भी भविष्यवाणी की पूर्ण लंबाई प्रोटीन की एकाग्रता में वृद्धि हो सकती है.
Refolded कणों की उम्मीद आकार रेंज में थे (20 से 100 एनएम)8,24,25 के रूप में डीएलएस और नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित. इन परिणामों को आगे TEM का उपयोग करके पुष्टि की गई. यदि इस चरण में समस्याएं हैं, यह सामान्य रूप से पीएच या refolding बफर के आयनिक शक्ति के साथ एक समस्या के कारण है. जब कण आकार तकनीक पर बड़े आकार के कणों का पता लगाया जाता है, तो यह एकत्रीकरण को इंगित करता है, जिसे रीफोल्ड बफर के पीएच को बढ़ाकर बचा या जा सकता है। यदि कणों डीएलएस द्वारा पता नहीं कर रहे हैं, प्रोटीन की एकाग्रता की पुष्टि करें और बफर के पीएच की जाँच करें। डीएलएस के लिए अंतिम प्रोटीन एकाग्रता कम से कम 100 g/ यदि एकाग्रता समस्या नहीं है, यह छोटे, अपूर्ण रूप से गठित कणों की बहुतायत को इंगित करता है, जिनकी एकाग्रता पीएच को कम करके कम की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, सोडियम क्लोराइड एकाग्रता इष्टतम रेंज के लिए समायोजित किया जा सकता है अवांछित आकार के साथ कणों की उपस्थिति को कम करने के लिए.
अंत में, शुद्धि के दौरान एक आइसोप्रोपेनोल धोने के कदम का उपयोग करके हम मेजबान ई. कोलाई से 0.01 यूरोपीय संघ / 28. इस स्तर को एक आयन विनिमय स्तंभ का उपयोग करके और भी कम किया जा सकता है Q स्तंभ के रूप में जाना जाता है। यदि endotoxin के उच्च स्तर अभी भी मौजूद हैं, सभी सामग्री है कि बफर तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया जाँच करें. इस विधि में केवल depyrogenated ग्लासवेयर और endotoxin मुक्त प्लास्टिक के बर्तन का उपयोग करने के लिए याद रखें.
इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हम सफलतापूर्वक SHB-SAPN कोर है कि पूर्व नैदानिक प्रतिरक्षण अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उत्पादन करने के लिए एक विधि विकसित की है. केवल मामूली संशोधनों के साथ इस विधि, यदि कोई हो, SHB-SAPNs के शुद्धिकरण के लिए लागू किया जा सकता है जब ब्याज की एक प्रतिजन जोड़ा जाता है. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस विधि का उपयोग प्रमुख परिवर्तनों में से एक elution कदम में है. विभिन्न इमिडाज़ोल सांद्रता में विभिन्न प्रोटीन एल्यूट जो प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किए जाने चाहिए। अन्य प्रमुख अंतर refolding बफर की संरचना हो सकती है. अनुकूलन विभिन्न पीएच शर्तों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आयनिक शक्तियों के परीक्षण की आवश्यकता होगी.
भविष्य के काम को ध्यान में रखते हुए, SHB-SAPN के मानव आवेदन की अनुमति देने के लिए केवल दो मामूली संशोधनों की आवश्यकता है। पहला यह है किमनुष्योंमें एम्पसिलिन एलर्जी के कारण अभिव्यक्ति वेक्टर को कानामाइसिन प्रतिरोध चयन मार्कर में बदलने की आवश्यकता है . मानव उपयोग के लिए प्रोटीन विनिर्माण की अन्य प्रमुख आवश्यकता पशु उत्पाद मुक्त मीडिया में SHB-SAPN का उत्पादन करने के लिए है। एक छोटे पैमाने पर अध्ययन पहले से ही एक संयंत्र आधारित मीडिया में प्रोटीन की उचित उपज का संकेत दिया. यहाँ प्रस्तुत काम आसानी से परम जीएमपी उत्पादन के लिए स्केलेबल के रूप में एक मलेरिया टीका उम्मीदवार, FMP01416के साथ प्रदर्शन किया है. इस बड़े पैमाने पर FMP014-SAPN उत्पादन दोनों anion विनिमय और अंतिम उत्पाद से LPS और Ni2 + सामग्री को कम करने के लिए धन विनिमय कदम शामिल थे। यह जीवाणु-एक्सप्रेस्ड एसएपीएन को आगामी चरण 1/2a नैदानिक परीक्षण के लिए पहले ही बढ़ाया जा चुका है।
The authors have nothing to disclose.
यह काम सैन्य चिकित्सा, इंक, और अमेरिकी रक्षा विभाग की उन्नति के लिए हेनरी एम जैक्सन फाउंडेशन के बीच एक सहकारी समझौते (W81XWH-11-2-0174) द्वारा समर्थित किया गया था। विरोधी HIV-1 gp41 mAb 167-डी चतुर्थ एंटीबॉडी NIH एड्स अभिकर्मक कार्यक्रम के माध्यम से डॉ सुसान ज़ोला-Pazner से प्राप्त किया गया था।
10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |