En detaljeret metode er givet her beskriver rensning, refolkning, og karakterisering af selvsamlende protein nanopartikler (SAPNs) til brug i vaccine udvikling.
Selvsamlende protein nanopartikler (SAPNs) fungerer som gentagne antigen displays og kan bruges til at udvikle en bred vifte af vacciner til forskellige smitsomme sygdomme. I denne artikel viser vi en metode til at producere en SAPN kerne, der indeholder en seks-Helix Bundle (SHB) samling, der er i stand til at præsentere antigener i en trimert kropsbygning. Vi beskriver udtrykket af SHB-SAPN i et E. coli -system, samt de nødvendige protein rensning trin. Vi inkluderede et isopropanol vaske trin for at reducere rest bakterien lipopolysaccharid. Som en indikation af protein identitet og-renhed reagerede proteinet med kendte monoklonale antistoffer i Western blot-analyser. Efter at have refoldet, faldt størrelsen af partiklerne i det forventede interval (20 til 100 nm), som blev bekræftet af dynamisk lysspredning, nanopartikel tracking analyse, og transmission elektronmikroskopi. Den beskrevne metode er optimeret til SHB-SAPN, men med kun små modifikationer kan den anvendes på andre SAPN konstruktioner. Denne metode er også let overføres til storstilet produktion til GMP fremstilling for humane vacciner.
Mens den traditionelle vaccine udvikling har fokuseret på de inaktiverede eller svækkede patogener, er fokus for moderne vacciner flyttet mod underenhed vacciner1. Denne tilgang kan føre til en mere målrettet respons, og potentielt mere effektive vaccinekandidater. En af de største ulemper er imidlertid, at under enheds vacciner ikke er partikler som hele organismer, hvilket kan resultere i nedsat immunogenicitet2. En nanopartikel som et gentaget antigen display system kan have fordelene ved både den målrettede underenhed vaccine tilgang samt partikel karakter af hele organismen1,3.
Blandt de eksisterende typer af nanovacciner giver rationelt designede protein samlinger mulighed for udformning og udvikling af vaccinekandidater, der kan præsentere flere eksemplarer af antigen potentielt i en indfødt-lignende kropsbygning1,4 ,5,6. Et eksempel på disse protein samlinger er de selvsamlende protein nanopartikler (SAPNs)7. SAPNs er baseret på coiled-Coil domæner og er traditionelt udtrykt i Escherichia coli8. Sapn vaccinekandidater er blevet udviklet til en række forskellige sygdomme som malaria, SARS, influenza, Toxoplasmose, og HIV-19,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. hver sapn-kandidats udformning er specifik for det patogen, der er interesse, men produktions-, rensnings-og refoldnings teknikken er generelt alment anvendelig.
En af vores nuværende interesser er en effektiv HIV-1 vaccine. I RV144 — det eneste kliniske fase III-forsøg med en hiv 1-vaccine, der udviste beskeden effekt — var den reducerede infektionsrisiko korreleret med IgG-antistoffer mod V1V2-løkken i konvolut proteinet20,21. Den indfødte-lignende trikemeje præsentation af denne region menes at være vigtigt for beskyttende immunogenicitet22. For at præsentere V1V2 loop i så tæt på Native-lignende konstellation som muligt, vi udviklet et bevis på princippet SAPN vaccinekandidat, der indeholdt HIV-1 konvolut post-fusion Six-Helix Bundle (SHB) at præsentere V1V2 loop i den korrekte kropsbygning9 . Denne kandidat blev anerkendt af kendte monoklonale antistoffer mod HIV-1 konvolut protein. Mus immuniseret med V1V2-SHB-sapn rejst V1V2 specifikke antistoffer, at, vigtigst, bundet til gp70 V1V2, den korrekte konformationelle epitoper9. SHB-SAPN kernen kunne have andre funktioner ud over rollen som en bærer til HIV-1 V1V2 loop. Her beskriver vi en detaljeret metode til ekspression, oprensning, genfoldning og validering af SHB-SAPN kernen. Sekvens valget, nanoparti design, Molekylær kloning og omdannelse af E. coli er tidligere beskrevet9.
Nanoteknologi giver mange fordele og løsninger for udvikling af under enheds vaccine. Nanovaccines kan gentagne gange præsentere antigener som partikler til værts immunsystemet stigende immunogenicitet26. Mens der er mange forskellige typer af Nanovaccines, vi mener, at dem, der består af de Novo designet protein synes at være den stærkeste tilgang til vaccine udvikling1. De kan konstrueres uden nogen sekvenshomologi til værten proteiner og præsentere antigenet af interesse i tæt på indfødte-lignende kropsbygning samtidig give lave produktionsomkostninger og høje produkt udbytter. Et glimrende eksempel på denne fremgangsmåde er SAPN-teknologien, som vi har anvendt på vacciner mod flere smitsomme sygdomme7. Håndtering af vanskelighederne i HIV-1 vaccine udvikling, har vi konstrueret en unik SHB-SAPN kerne til effektivt at præsentere V1V2 antigen i en indfødt-lignende trimert kropsbygning9. Mange vaccine mål, især for virussygdomme, er til stede som trimere27. Dette fænomen indikerer, at vores sapn-design har store konsekvenser for udviklingen af underenhed vacciner.
I denne metode demonstrerer vi, hvordan man producerer SHB-SAPNs i et E. coli -udtryks system. Vi udtrykte høje udbytter af protein (ca. 6 mg/100 mL kultur). Proteinet indeholdt 10 histidiner og blev let renset ved hjælp af en immobiliseret metalaffinitets kromatografi med ni2 + kolonne. Denne længde af hans-tag blev fundet at være den optimale for den højeste proteinudbytte. Det rensede protein indeholdt den fulde længde af det designede protein, som indikeret ved tilstedeværelsen af både N-terminal HisTag og C-terminalen heptad REPEAT. Vi udnyttede bredt accepterede teknikker og optimeret dem til udtryk, produktion og karakterisering af SHB-SAPN kerne. Manglende produktion af fuld længde protein under udviklingen af en sapn indeholdende en ny protein epitop kunne indikere et udtryk problem med genet i værtscellen. Hvis det sker, skal genet og udtryks systemet redesignet og tilpasses til den beskrevne protokol. Ændring af sonikering tid eller intensitet kan også øge koncentrationen af den forventede fuld længde protein.
Refoldede partikler var i det forventede størrelsesinterval (20 til 100 nm)8,24,25 som bestemt af DLS og nanopartikel tracking analyse. Disse resultater blev yderligere bekræftet ved anvendelse af TEM. Hvis der er problemer i dette trin, er det normalt på grund af et problem med pH eller ionisk styrke af refolding buffer. Når store størrelse partikler detekteres på partikel størrelses teknikker, det indikerer aggregering, som kan undgås ved at øge pH af refolding buffer. Hvis partiklerne ikke detekteres af DLS, kontrollere koncentrationen af proteinet og kontrollere pH af bufferen. Den endelige proteinkoncentration for DLS bør være mindst 100 μg/mL. Hvis koncentrationen ikke er problemet, indikerer det overflod af små, ufuldstændigt dannede partikler, hvis koncentration kan reduceres ved at sænke pH. Alternativt kan natriumklorid koncentrationen justeres til det optimale område for at minimere tilstedeværelsen af partikler med uønsket størrelse.
Endelig, ved hjælp af en isopropanol vask trin under rensning var vi i stand til at reducere kontaminerende LPS fra værten E. coli til 0,01 EU/ΜG sapn, som er under Food and Drug Administration (FDA) grænse på 5 EU/kg legemsvægt for injicerbare produkter 28. dette niveau kan reduceres yderligere ved hjælp af en anion-udvekslings kolonne, også kendt som Q-kolonne. Hvis der stadig er høje niveauer af endotoksin, bør du kontrollere alle materialer, som blev brugt til buffer fremstilling. Husk at bruge kun depyrogenated glas og endotoksin gratis plasticware i denne metode.
Disse resultater indikerer, at vi med succes har udviklet en metode til at producere SHB-SAPN kerne, der kan anvendes til prækliniske immuniserings undersøgelser. Denne metode med kun små ændringer, hvis nogen, kan anvendes til rensning af SHB-SAPNs, når et antigen af interesse tilsættes. Ved hjælp af denne metode som udgangspunkt er en af de store ændringer i elueringstrinnet. Forskellige proteiner elueret ved forskellige imidazolkoncentrationer, der skal bestemmes eksperimentelt. Den anden store forskel kan være sammensætningen af den genfoldnings buffer. Optimering ville kræve afprøvning af forskellige pH-forhold samt Ioniske styrker.
I betragtning af det fremtidige arbejde er der kun behov for to små ændringer for at tillade anvendelse af SHB-SAPN på mennesker. Den første er, at udtrykket vektor skal ændres til en kanamycin resistens valgbar markør på grund af ampicillin allergi i mennesker29. Det andet store krav til protein fremstilling til human brug er at fremstille SHB-SAPN i animalske produkt frie medier. En undersøgelse i mindre målestok viste allerede et rimeligt udbytte af protein i et plantebaseret medie. Det arbejde, der præsenteres her, er let skalerbar til ultimativ GMP-produktion som demonstreret med en malariavaccine kandidat, FMP01416. Denne store FMP014-SAPN-produktion omfattede både anionbytningen og kation udvekslings trinnene for yderligere at reducere LPS-og ni2 + -indholdet fra det endelige produkt. Denne bakterielle-udtrykte SAPN er allerede blevet opskaleret til et kommende fase 1/2A klinisk forsøg.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en samarbejdsaftale (W81XWH-11-2-0174) mellem Henry M Jackson Foundation til fremme af militær medicin, Inc., og det amerikanske forsvarsministerium. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV-antistoffet blev modtaget fra Dr. Susan Zolla-Pazner gennem NIH AIDS-reagens programmet.
10x Tris/Glycine/SDS | BioRad | 1610732 | 1 L |
2-Mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | 25 mL |
2-propanol | Fisher | BP26181 | 4 L |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610737 | 30 mL |
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers | Malvern Panalytical | ZEN0040 | 100 pack |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | BioRad | 4561093 | 10 pack |
Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | 25 g |
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8] | AbCam | ab18184 | 100 mg |
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV) | AIDS Reagent Repository | 11681 | 100 mg |
BCIP/NBT Substrate, Solution | Southern Biotech | 0302-01 | 100 mL |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-108 | A variety of sizes |
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm | Ted Pella, Inc | 01754-F | 25 pack |
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns | GE HealthCare | 45-000-325 | 5 pack |
Glycerol | Fisher | BP229-4 | 4 L |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) | ABCam | ab97020 | 1 mg |
Imidazole | Fisher | O3196-500 | 500 g |
Instant NonFat Dry Milk | Quality Biological | A614-1003 | 10 pack |
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay | Lonza Walkersville | 50650U | 192 Test Kit |
LAL Reagent Grade Multi-well Plates | Lonza Walkersville | 25-340 | 1 plate |
Magic Media E. coli Expression Medium | ThermoFisher | K6803 | 1 L |
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters | Millipore | SLGV033RB | 250 pack |
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP | Southern Biotech | 9040-04 | 1.0 mL |
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli | ThermoFisher | C601003 | 20 vials |
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, | BioRad | 1610363 | 1 mL |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL | ThermoFisher | 66810 | 8 pack |
Sodium Chloride | Fisher | BP358-212 | 2.5 kg |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | BP329-500 | 500 g |
Tris Base | Fisher | BP152-1 | 1 kg |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Biosynth International | C-1818 | 100 g |
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S | Electron Micoscopy Services | 541-09-3 | 25 g |
Urea | Fisher | BP169-500 | 2.5 kg |
Whatman qualitative filter paper | Sigma Aldrich | WHA10010155 | pack of 500 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
ChromLab Software ver 4 | BioRad | 12009390 | Software |
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2 | Plate Reader |
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor | ThermoFisher | 096-145075 | Rotor |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Gel Imager for Stain free Gels |
JEOL TEM | JEOL | 1400 | Transmission Electron Microscope |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BioRad | 1658004 | To run gels |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | For Protein Concentration |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
NanoSight NTA software NTA | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
New Brunswick Innova 44/44R | Eppendorf | M1282-0000 | Incubator/Shaker |
NGC Quest 10 Chromatography System | BioRad | 7880001 | FPLC to aid in protein purification |
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella, INC | 91000S | To clean grids |
PowerPac Universal Power Supply | BioRad | 1645070 | To run gels |
Rocker Shaker | Daigger | EF5536A | For Western |
Sonifer 450 | Branson | also known as 096-145075 | Sonicator |
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher | 75-006-580 | Centrifuge |
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs | BioRad | 1704158 | For Western |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 | For Western |
Vortex-Genie 2 | Daigger | EF3030A | Vortex |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Particle Sizing | |
Zetasizer Software | Malvern Panalytical | Particle Sizing |