Summary

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

Published: August 17, 2019
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Summary

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

Abstract

As enzimas ATPase utilizam a energia livre armazenada em trifosfato de adenosina para catalisar uma grande variedade de processos bioquímicos endergônicos in vivo que não ocorreriam espontaneamente. Estas proteínas são cruciais para essencialmente todos os aspectos da vida celular, incluindo o metabolismo, divisão celular, respostas a mudanças ambientais e movimento. O protocolo aqui apresentado descreve um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo que foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de ATPase de pequenas moléculas. O ensaio foi aplicado à miosina II do músculo cardíaco e esquelético, dois ATPases motores moleculares à base de actina, como prova de princípio. A hidrólise do ATP é acoplada à oxidação de NADH por reações enzimáticas no ensaio. Primeiramente, o ADP gerado pelo ATPase é regenerado ao ATP pelo piruvato kinase (PK). PK catalisa a transição de fosfoenolpiruvato (PEP) para piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH), que catalisa a oxidação de NADH paralelamente. Assim, a diminuição da concentração de ATP está diretamente correlacionada com a diminuição da concentração de NADH, que se segue da mudança para a fluorescência intrínseca da NADH. Contanto que o PEP esteja disponível no sistema de reação, a concentração de ADP permanece muito baixa, evitando a inibição da enzima ATPase pelo seu próprio produto. Além disso, a concentração de ATP permanece quase constante, produzindo cursos de tempo linear. A fluorescência é monitorada continuamente, o que permite uma fácil estimativa da qualidade dos dados e ajuda a filtrar artefatos potenciais (por exemplo, decorrentes de precipitação composta ou alterações térmicas).

Introduction

Myosins são transdutores de energia Mecanoquímica que hidrolisam trifosfato de adenosina (ATP) para gerar movimento direcional ao longo dos filamentos do citoesqueleto de actina em eucariontes1,2. Eles têm tanto estruturalmente e kineticamente adaptados às suas várias funções intracelulares, como o transporte de organelas, contração muscular ou a geração de tensão citoesquelética1,2. A superfamília da miosina é representada por ~ 40 genes de miosina pertencentes a ~ 12 classes distintas de miosina no genoma humano3,4. Os membros das classes de miosina desempenham vários papéis em um conjunto altamente diversificado de distúrbios, como vários cânceres, distúrbios neurológicos, miopatias esqueléticas e cardiomiopatia hipertrófica5,6. Dado o grande número de funções fisiológicas e patológicas destes motores moleculares, não é surpreendente que eles estão se tornando cada vez mais reconhecidos como alvos de drogas para uma variedade de condições7. Avanços significativos foram feitos recentemente na descoberta de novos inibidores da miosina8,9,10 e ativadores11, e para melhorar as propriedades dos já existentes12, 13 anos de , 14 anos de , quinze anos.

A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH)-acoplado ATPase ensaio tem sido usado para medir a atividade ATPase de várias enzimas, tais como o retículo sarcoplasmático CA2 + bomba ATPase16, o reparo de DNA ATPase RAD5417, o AAA + ATPase p9718 ou o motor microtúnica cinesina19. O ensaio emprega um ciclo de regeneração ATP. O difosfato de adenosina (ADP) gerado pela ATPase é regenerado para ATP por piruvato quinase (PK), que transforma uma molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) em piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH). Isso, por sua vez, oxida uma molécula de NADH a NAD. Portanto, a diminuição da concentração de NADH em função do tempo é igual à taxa de hidrólise do ATP. O ciclo de regeneração ATP mantém a concentração de ATP quase constante e a concentração de ADP baixa, contanto que PEP esteja disponível. Isso resulta em cursos de tempo linear, tornando simples determinar as taxas de reação inicial e ajuda a evitar a inibição do produto pela ADP19. Embora o ensaio ATPase acoplado ao NADH já tenha sido adaptado a um formato 96-bem20, os volumes de alta reação (~ 150 μL) tornam-se relativamente dispendiosos devido à alta demanda de reagentes, tornando-o menos adequado à rápida triagem de um grande número de Compostos. Métodos alternativos, como o ensaio verde de Malaquita19,21, que depende da detecção do fosfato produzido pela enzima ATPase, foram comprovados mais adequados para miniaturização e triagem de alta produtividade22 , 23 anos de , 24. no entanto, um ensaio de ponto final é mais susceptível de ser afectado por vários artefactos (discutidos abaixo), que podem continuar a não ser descobertos na ausência de cursos a tempo inteiro.

Aqui, o ensaio ATPase acoplado à NADH foi otimizado para triagem de produção semialta de inibidores de pequenas moléculas. O músculo esquelético e cardíaco miosina II e os inibidores da miosina blebbistatina8 , para-aminoblebbistatin13 e para-nitroblebbistatin12 são utilizados para demonstrar o poder do ensaio, que se baseia na NADH fluorescência como uma leitura. Este protocolo é capaz de triagem de projetos focados em qualquer ADP produzindo enzimas.

Protocol

1. preparação de soluções de estoque e reagentes Prepare a solução de ações ditiotreitol (DTT) dissolvendo a DTT cristalina em água destilada até uma concentração final de 1000 mm. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Alíquota e armazene a-20 ° c. Prepare a solução de estoque ATP dissolvendo ATP cristalino em água destilada para uma concentração final de 100 mM. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Alíquota e armazene a-20 ° c. Prepare 10x NAD…

Representative Results

O mapa de layout de placa típico usado para experimentos de triagem é mostrado na Figura 1. As primeiras e as últimas fileiras são reservadas para a calibração de NADH e o controle positivo (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), respectivamente. As linhas restantes (B a O) são usadas para testar a atividade inibitória de compostos. Aqui, as diluições de série 1:2 de quinze passos que partem da concentração composta de 10 mM no DMSO …

Discussion

Etapas críticas no protocolo

Otimize o layout da placa executando várias placas com controle negativo somente (reação de ATPase sem inibidor). Inspecione os resultados cuidadosamente para padrões em taxas de reação. Por exemplo, estes podem surgir de efeitos de aresta e/ou imperfeições no revestimento de superfície hidrófilo de placas “não vinculantes”. Se um padrão for observado, mude o tipo de chapa e/ou o layout da placa para minimizar os artefatos. Por exemplo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC e Instituto Nacional de abuso de drogas NS096833 (CAM).

Materials

384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

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Cite This Article
Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

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