Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules
Summary
Un test ATPase couplé à la nicotinamide adenine (NADH) a été adapté au dépistage semi-élevé de la myosine par petite molécule. Cet essai cinétique est exécuté dans un format microplate de 384 puits avec des volumes de réaction totaux de seulement 20 L par puits. La plate-forme devrait s’appliquer à pratiquement n’importe quelle enzyme productrice d’ADP.
Abstract
Les enzymes ATPase utilisent l’énergie libre stockée dans le triphosphate d’adénosine pour catalyser une grande variété de processus biochimiques endergoniques in vivo qui ne se produiraient pas spontanément. Ces protéines sont cruciales pour essentiellement tous les aspects de la vie cellulaire, y compris le métabolisme, la division cellulaire, les réponses aux changements environnementaux et le mouvement. Le protocole présenté ici décrit un nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-couplé ATPase-assay qui a été adapté au criblage semi-haut de débit des inhibiteurs de petite molécule d’ATPase. L’analyse a été appliquée à la myosine du muscle cardiaque et squelettique II, deux ATPases à base d’actine, comme preuve de principe. L’hydrolyse de l’ATP est couplée à l’oxydation de NADH par des réactions enzymatiques dans l’effort. Tout d’abord, l’ADP généré par l’ATPase est régénéré en ATP par pyruvate kinase (PK). PK catalyse la transition du phosphoenolpyruvate (PEP) à la pyruvate en parallèle. Par la suite, le pyruvate est réduit au lactate par la déshydrogénase de lactate (LDH), qui catalyse l’oxydation du NADH en parallèle. Ainsi, la diminution de la concentration d’ATP est directement corrélée à la diminution de la concentration de NADH, qui est suivie du changement à la fluorescence intrinsèque de NADH. Tant que la PPE est disponible dans le système de réaction, la concentration d’ADP reste très faible, évitant l’inhibition de l’enzyme ATPase par son propre produit. En outre, la concentration atp reste presque constante, donnant des cours de temps linéaires. La fluorescence est surveillée en permanence, ce qui permet d’estimer facilement la qualité des données et aide à filtrer les artefacts potentiels (p. ex., résultant de précipitations composées ou de changements thermiques).
Introduction
Les myosines sont des transducteurs d’énergie mécanochimique qui hydrolysent l’adénosine triphosphate (ATP) pour générer un mouvement directionnel le long des filaments du cytosquelette d’actine chez les eucaryotes1,2. Ils se sont adaptés structurellement et kinétiquement à leurs différentes fonctions intracellulaires, telles que le transport d’organites, la contraction musculaire ou la génération de tension cytosquelettique1,2. La superfamille de myosine est représentée par 40 gènes de myosine appartenant à 12 classes distinctes de myosine dans le génome humain3,4. Les membres des classes de myosine jouent divers rôles dans un ensemble très divers de désordres, tels que plusieurs cancers, désordres neurologiques, myopathies squelettiques, et cardiomyopathie hypertrophique5,6. Étant donné le grand nombre de fonctions physiologiques et pathologiques de ces moteurs moléculaires, il n’est pas surprenant qu’ils soient de plus en plus reconnus comme cibles médicamenteuses pour une variété de conditions7. Des progrès significatifs ont été réalisés récemment dans la découverte de nouveaux inhibiteurs de la myosine8,9,10 et activateurs11, et d’améliorer les propriétés des existants12, 13 (en) , 14 (en) , 15.
L’analyse ATPase couplée à la nicotinamide adenine (NADH) a longtemps été utilisée pour mesurer l’activité ATPase de diverses enzymes, telles que le réticulum sarcoplasmique Ca2 pompe ATPase16, la réparation de l’ADN ATPase Rad5417, l’AAA ATPase p9718 ou la kinésine moteur microtubule19. L’analyse utilise un cycle de régénération ATP. L’adénosine diphosphate (ADP) généré par l’ATPase est régénéré en ATP par pyruvate kinase (PK), qui transforme une molécule de phosphoenolpyruvate (PEP) en pyruvate en parallèle. Par la suite, le pyruvate est réduit au lactate par la déshydrogénase de lactate (LDH). Cela, à son tour, oxyde une molécule de NADH à NAD. Par conséquent, la diminution de la concentration de NADH en fonction du temps équivaut au taux d’hydrolyse atp. Le cycle de régénération de l’ATP maintient la concentration d’ATP presque constante et la concentration ADP faible tant que le PEP est disponible. Il en résulte des cours de temps linéaires, ce qui rend simple de déterminer les taux de réaction initiaux et aide à éviter l’inhibition du produit par ADP19. Bien que l’assay ATPase couplé au NADH ait déjà été adapté à un format de 96 puits20, les volumes de réaction élevés (150 l) le rendent relativement cher en raison de la forte demande de réactifs, ce qui le rend moins propice à un dépistage rapide d’un grand nombre de Composés. D’autres méthodes, telles que l’essai vert malachite19,21, qui repose sur la détection du phosphate produit par l’enzyme ATPase, se sont avérées plus appropriées pour la miniaturisation et le dépistage à haut débit22 , 23 Ans, états-unis , 24. Cependant, un point de terminaison est plus susceptible d’être affecté par plusieurs artefacts (discutés ci-dessous), qui peuvent rester inconnus en l’absence de cours à temps plein.
Ici, l’analyse ATPase couplée nADH a été optimisée pour le criblage semi-haut de débit des inhibiteurs de petite molécule. La myosine des muscles squelettiques et cardiaques II et les inhibiteurs de la myosine blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 et para-nitroblebbistatin12 sont utilisés pour démontrer la puissance de l’avertissement, qui repose sur NADH fluorescence comme une lecture. Ce protocole est propice aux projets de dépistage axés sur les enzymes productrices d’ADP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques du protocole
Optimisez la disposition des plaques en exécutant plusieurs plaques avec un contrôle négatif seulement (réaction ATPase sans inhibiteur). Inspectez soigneusement les résultats pour les tendances des taux de réaction. Par exemple, ceux-ci peuvent résulter d’effets de bord et/ou d’imperfections dans le revêtement hydrophile de surface des plaques « non contraignantes ». Si un modèle est observé, changez le type de plaque et/ou la dispos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Neurological Disorders and Stroke et du National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM).
Materials
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Sodium azide) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optical Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) | Sigma | P9136 | |
| Rabbit Muscle Acetone Powder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
References
- Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
- Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
- Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
- He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
- Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
- Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
- Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
- Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
- Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
- Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
- Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
- Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3′-hydroxyblebbistatin and (S)-3′-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
- Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
- Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
- Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
- Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
- Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
- Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
- Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
- Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
- Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
- Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
- Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
- Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
- Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
- Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
- Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?. Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
- See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
- Datta, A., Brosh, R. M. New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).
