소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

묘신은 진핵생물^1,2에서액틴 세포골격의 필라멘트를 따라 방향운동을 생성하기 위해 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 가수분해하는 메카노케미컬 에너지 트랜스듀서이다. 그(것)들은 세포기관의 수송, 근육 수축 또는 세포골격 긴장의 생성과 같은 그들의 각종 세포내 기능에 구조적으로 그리고 운동적으로 적응한^1,2. 상기 미오신 수퍼패밀리는 인간 게놈^3,4에서~12개의 뚜렷한 묘신 클래스에 속하는 ~40개의 미오신 유전자로 나타난다. 미오신 클래스의 구성원은 여러 암, 신경 장애, 골격 근병증 및 비대성 심근병증^5,6과같은 매우 다양한 장애 세트에서 다양한 역할을 한다. 이러한 분자 모터의 많은 생리적 및 병리학적 기능을 감안할 때, 다양한 조건에 대한 약물 표적으로 점점인식되고 있는 것은 놀라운 일이 아니다 7. 최근 새로운 미오신 억제제^8,9,10 및 활성제^11의발견에 상당한 진전이 이루어졌으며, 기존 12의 특성을^{개선하고, 13세 , 14세 , 15}.

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 ATPase 분석기는 오랫동안 사르코플라스 망상 Ca²⁺ 펌프 ATPase^16,DNA 수리 ATPase Rad54^17,AAA+와 같은 다양한 효소의 ATPase 활성을 측정하는 데 사용되어 왔습니다. ATPase p97¹⁸ 또는 미세소관 모터 키네신^19. 이 분석은 ATP 재생 주기를 사용합니다. ATPase에 의해 생성된 아데노신 디포스페이트(ADP)는 피루바테 키나아제(PK)에 의해 ATP로 재생되며, 이는 인산피루바트(PEP)의 한 분자를 병렬로 피루베이트로 변형시킵니다. 그 후, 피루브산염은 젖산 탈수소 효소 (LDH)에 의해 젖산으로 감소됩니다. 즉, 차례로, NAD에 NADH의 한 분자를 산화. 따라서, 시간의 함수로서 NADH 농도의 감소는 ATP 가수분해 속도와 같다. ATP 재생 주기는 PEP를 사용할 수 있는 한 ATP 농도를 거의 일정하게 유지하고 ADP 농도를 낮게 유지합니다. 이것은 선형 시간 과정을 초래, 쉽게 초기 반응 속도를 결정하고 ADP^19에의해 제품 억제를 방지하는 데 도움이. NADH 결합 ATPase 분석은 이미 96 웰 포맷^20에적응되었지만, 높은 반응 량 (~150 μL)은 시약의 높은 수요로 인해 상대적으로 비싸므로 많은 수의 빠른 스크리닝이 덜 가능합니다. 화합물. ATPase 효소에 의해 생성된 인산염의 검출에 의존하는 말라카이트 녹색 분석법^19,21과같은 대체 방법은 소형화 및 고처리량 스크리닝(22)에 더 적합한 것으로 입증되었습니다. ^{, 23세 , 24}. 그러나 끝점 분석기는 풀 타임 과정이 없는 상태에서 발견되지 않은 상태로 남아있을 수있는 여러 유물 (아래에 설명됨)의 영향을받을 가능성이 높습니다.

여기서, NADH-결합 된 ATPase 분석기는 소분자 억제제의 반 높은 처리량 스크리닝에 최적화되었습니다. 골격 및 심장 근육 myosin II와 myosin 억제제 blebbistatin^8, 파라-aminoblebbistatin¹³ 및 파라-nitroblebbistatin¹² 는 NADH에 의존하는 분석의 힘을 입증하기 위하여 이용됩니다 판독으로 형광. 이 프로토콜은 모든 ADP 생산 효소에 초점을 맞춘 스크리닝 프로젝트에 사용할 수 있습니다.