A semi-High-gjennomstrømning tilpasning av NADH-koblet ATPase analysen for screening små molekyl hemmere
Summary
En nikotinamid adenine dinucleotide (NADH)-koblet ATPase analysen har blitt tilpasset semihigh gjennomstrømning screening av små molekyl myosin hemmere. Denne kinetisk analysen kjøres i et 384-brønn mikroplate format med totalt reaksjons volum på bare 20 μL per brønn. Plattformen bør være aktuelt for nesten alle ADP produserende enzym.
Abstract
ATPase enzymer utnytte den frie energien som er lagret i adenosin trifosfat å katalysere et bredt utvalg av endergon biokjemiske prosesser in vivo som ikke ville oppstå spontant. Disse proteinene er avgjørende for i hovedsak alle aspekter av mobilnettet liv, inkludert metabolisme, celledeling, tiltak mot miljømessige endringer og bevegelse. Protokollen som presenteres her beskriver en nikotinamid adenine dinucleotide (NADH)-kombinert ATPase analysen som har blitt tilpasset semi-høy gjennomstrømming screening av små molekyl ATPase hemmere. Analysen har blitt brukt til CARDIAC og skjelettlidelser muskel myosin II ‘ s, to utgangen-baserte molekylær motor ATPases, som et bevis på prinsippet. Hydrolyse av ATP er koplet til oksidasjon av NADH ved enzymatisk reaksjoner i analysen. Først genereres ADP av ATPase til ATP ved pyruvat kinase (PK). PK katalyserer overgangen av phosphoenolpyruvate (PEP) til pyruvat parallelt. Deretter reduseres pyruvat til melkesyre dehydrogenase (LDH), som katalyserer oksidasjon av NADH parallelt. Dermed er reduksjonen i ATP konsentrasjon direkte korrelert til nedgangen i NADH konsentrasjon, som etterfølges av endring i iboende fluorescens av NADH. Så lenge PEP er tilgjengelig i reaksjonssystemet, er ADP-konsentrasjonen fortsatt svært lav, og unngår hemming av ATPase-enzymet ved sitt eget produkt. Videre forblir ATP konsentrasjonen nesten konstant, noe som gir lineær tid kurs. Fluorescens overvåkes kontinuerlig, noe som gjør det mulig for enkel estimering av kvaliteten på dataene og bidrar til å filtrere ut potensielle artefakter (for eksempel som følge av sammensatte nedbørsmengder eller termiske endringer).
Introduction
Myosins er mekanokjemiske energi-transdusere som hydrolyserer adenosin trifosfat (ATP) til å generere retningsbestemt bevegelse langs filamenter av utgangen cytoskeleton i Landplantenes1,2. De har både strukturelt og Kinetically tilpasset sine ulike intracellulære funksjoner, slik som transport av organeller, muskel sammentrekning eller generering av cytoskjelettkomponenter penning1,2. Den myosin overfamilie er representert ved ~ 40 myosin gener som tilhører ~ 12 distinkte myosin klasser i den menneskelige Genova3,4. Medlemmer av myosin klassene spille ulike roller i et svært mangfoldig sett av lidelser, for eksempel flere kreftformer, nevrologiske lidelser, skjelettlidelser myopatier, og hypertrofisk kardiomyopati5,6. Gitt det store antall fysiologiske og patologiske funksjoner av disse molekylære motorene, er det ikke overraskende at de blir stadig mer anerkjent som narkotika mål for en rekke forhold7. Betydelig fremgang har blitt gjort nylig i oppdagelsen av nye myosin hemmere8,9,10 og aktivator11, og for å forbedre egenskapene til eksisterende12, 13 på alle , 14 priser og priser , 15av dem.
Den nikotinamid adenine dinucleotide (NADH)-kombinert ATPase analysen har lenge vært brukt til å måle ATPase aktiviteten av ulike enzymer, slik som sarcoplasmic retikulum ca2 + Pump ATPase16, DNA reparasjon ATPASE Rad5417, AAA + ATPase p9718 eller mikrotubulinettverket motoren kinesin19. Analysen sysselsetter en ATP gjenfødelse syklus. Adenosin uridindifosfatglukuronosyltransferase (ADP) generert av ATPase, genereres på ATP ved pyruvat kinase (PK), som forvandler ett molekyl av phosphoenolpyruvate (PEP) til pyruvat parallelt. Deretter reduseres pyruvat til melkesyre dehydrogenase (LDH). Det i sin tur oksiderer ett molekyl av NADH til NAD. Derfor tilsvarer reduksjonen i NADH-konsentrasjonen som en funksjon av tid ATP hydrolyse rate. ATP gjenfødelse syklusen holder ATP konsentrasjonen nesten konstant og ADP konsentrasjon lavt så lenge PEP er tilgjengelig. Dette resulterer i lineær tid kurs, noe som gjør det enkelt å bestemme de første reaksjons hastigheter og bidrar til å unngå produkt hemming av ADP19. Selv om den NADH-sammenkoblede ATPase-analysen allerede er tilpasset et 96-format20, gjør høy reaksjons volumene (~ 150 μL) det relativt dyrt på grunn av den høye etterspørselen av reagenser, noe som gir det mindre mottagelig for rask screening av et stort antall Forbindelser. Alternative metoder, slik som malakitt grønne analysen19,21, som er avhengig av påvisning av fosfat produsert av ATPase enzymet, ble påvist mer egnet for miniatyrisering og høy gjennomstrømming screening22 , 23 andre , 24. imidlertid er et endepunkt analysen mer sannsynlig å bli påvirket av flere gjenstander (omtalt nedenfor), som kan forbli uoppdaget i fravær av heltidskurs.
Her har NADH-koplet ATPase analysen er optimalisert for semi-høy gjennomstrømming screening av små molekyl hemmere. Skjelettlidelser og hjerte muskel myosin II og myosin hemmere blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 og para-nitroblebbistatin12 brukes til å demonstrere kraften i analysen, som er avhengig av NADH fluorescens som en avlesning. Denne protokollen er mottagelig for screening prosjekter fokusert på alle ADP produsere enzymer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Optimaliser plate layout ved å kjøre flere plater med negativ kontroll bare (ATPase reaksjon uten inhibitor). Inspiser resultatene nøye for mønstre i reaksjons rater. For eksempel kan disse oppstå fra kanteffekter og/eller ufullkommenheter i hydrofile overflatebelegg av “ikke-bindende” plater. Hvis et mønster er observert, endre platetype og/eller plate layout for å minimere artefakter. For eksempel kan en typisk dose respons kurve (16 konse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag og nasjonalt Institutt for narkotikamisbruk NS096833 (CAM).
Materials
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Sodium azide) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optical Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) | Sigma | P9136 | |
| Rabbit Muscle Acetone Powder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
References
- Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
- Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
- Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
- He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
- Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
- Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
- Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
- Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
- Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
- Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
- Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
- Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3′-hydroxyblebbistatin and (S)-3′-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
- Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
- Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
- Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
- Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
- Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
- Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
- Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
- Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
- Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
- Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
- Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
- Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
- Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
- Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
- Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?. Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
- See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
- Datta, A., Brosh, R. M. New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).
