Ensaios de atividade com base em RMN para determinação da inibição de compostos, valores de IC₅₀ , atividade Artifactual e atividade de células inteiras de Ribohidrolases nucleósidos

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é bem estabelecida para caracterizar e monitorar as reações enzimáticas^1,2. As diferenças nos deslocamentos químicos e nos padrões de acoplamento são usadas para distinguir as ressonâncias do substrato e do produto, e as intensidades de ressonância relativas são usadas para quantificar o percentual de reação. Tanto o consumo de substrato quanto a criação do produto são observados diretamente no espectro de RMN. Isso contrasta com a espectrofotometria ou espectroscopia de fluorescência, na qual o curso de tempo de reação é indicado por uma alteração na absorvência atribuível a algumas espécies químicas que estão sendo consumidas ou criadas. Assim como com os outros métodos, RMN pode ser usado para estudar as reações enzimáticas em função da temperatura, pH, ou outras condições da solução, e os efeitos dos inibidores podem ser determinados.

Mais recentemente, foram demonstrados os ensaios de atividade enzimática baseada em RMN para a triagem de fragmentos^3,4. Os ensaios baseados em RMN são ideais para trabalhar nas concentrações mais elevadas de compostos de ensaio (frequentemente tão elevados como 1 mM) necessários para detectar estes inibidores mais fracos. A escala dinâmica e a dispersão química do deslocamento na experimentação de RMN podem facilmente resolver ressonâncias do substrato, do produto, e dos compostos do teste. Isto compara favoràvel aos ensaios espectrofotométricos onde os problemas da interferência da leitura-para fora levantam-se frequentemente dos compostos com perfis de absorção UV-VIS de sobreposição. Além, desde que faltam enzimas do repórter, os ensaios da RMN da único-enzima não são propensas aos falsos positivos acoplados-ensaio. Essa vantagem os torna úteis como ensaios ortogonais, complementando os ensaios tradicionais de triagem de alta produtividade e os ensaios de triagens de bancada⁵.

Em nosso laboratório de pesquisa, os ensaios de atividade baseados em RMN são usados para identificar e avaliar os inibidores de Trichomonas vaginalis nucleosídeo ribohydrolases. O parasita T. vaginalis causa a doença sexualmente transmissível não viral mais prevalente⁶. Aumentar a resistência às terapias existentes⁷ está conduzindo a necessidade para tratamentos novos, mecanismo-baseados, com as enzimas essenciais do caminho do salvamento do nucleosídeo que representam alvos principais⁸. Foram desenvolvidos ensaios de atividade baseados em RMN para as enzimas pirimidina e Purina específicas, a ribohydrolase do nucleosídeo uridina (UNH)⁹e a adenosina/guanosina preferindo a ribohidlase nucleosídeo (agnh)¹⁰. As reações catalisadas por estas duas enzimas são mostradas na Figura 1. Os ensaios de RMN estão sendo usados para fazer a tela de bibliotecas de fragmentos para pontos de partida químicos, determinar os valores de IC₅₀ e eliminar inibidores de ligação com base em agregação ou covalentes¹¹. Os mesmos ensaios também estão sendo traduzidos para avaliar a atividade enzimática em células inteiras¹².

Os protocolos detalhados são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC₅₀ , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli . Os protocolos são geralmente aplicáveis a qualquer enzima em que as ressonâncias de substrato e produto podem ser observadas e distinguidas pela espectroscopia de RMN. Três suposições foram feitas para a simplicidade. Primeiro, o substrato não é especificado. Para que os ensaios de atividade baseados em RMN sejam úteis, a concentração final do substrato deve ser não superior a 2-3x o valor de K_m ⁴. Nos exemplos mostrados, as concentrações finais de adenosina e 5-fluorouridina são 100 μM (k_m = 54 μM) e 50 μm (k_m = 15 μm), respectivamente. Nos protocolos, atingir estas concentrações corresponde a 12 μL de 5 mM de adenosina ou 12 μL de 2,5 mM 5-fluorouridina.

Em segundo lugar, a quantidade de enzima prevista nos protocolos, 5 μL, foi escolhida para corresponder à quantidade necessária para resultar em aproximadamente 75% de conversão do substrato para o produto em 30 min. Esta quantidade representa tipicamente uma grande diluição de um estoque purified da enzima, e a diluição deve ser determinada adiantado para cada enzima. As soluções de estoque de enzimas purificadas AGNH e UNH são armazenadas em-80 ° c em alíquotas que fornecem enzima suficiente para várias milhares de reações. Assim, o fator de diluição idealmente só precisa ser determinado ou validado a cada poucos meses. Em terceiro lugar, o experimento NMR 1D específico não é especificado. Nos resultados representativos, ¹H NMR é mostrado para agnh¹⁰ e ¹⁹F NMR é mostrado para unh⁹, com o experimento de RMN descrito nas referências correspondentes. A escolha do experimento de RMN depende da reação enzimática e dos substratos disponíveis, bem como da instrumentação de RMN disponível. Por fim, deve-se salientar que a abordagem experimental descrita não adere às rigorosas exigências da RMN quantitativa (qnmr)^13,14. No protocolo, uma reação percentual é determinada usando as alterações relativas na intensidade da mesma ressonância em cada espectro, em vez de determinar concentrações absolutas. Essa abordagem elimina a necessidade de aquisição de dados e modificações de processamento, bem como padrões internos ou externos, que são necessários para qNMR.