NMR القائمة على تحليل النشاط لتحديد تثبيط مركب, قيم IC50, نشاط Artifactual, ونشاط الخلية الكاملة من النوكليوسيد الريبوهيدرولاسيس
Summary
وقد وضعت اختبارات النشاط القائمة على NMR لتحديد وتوصيف مثبطات اثنين من الإنزيمات الريبوهيدرولاز النوكليوسيد. يتم توفير بروتوكولات للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، واختبارات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها.
Abstract
وكثيراً ما يستخدم التحليل الطيفي لـ NMR لتحديد وتوصيف مثبطات الإنزيم في اكتشاف الأدوية، ولا سيما في سياق فحص الشظايا. وتختبر الاختبارات القائمة على النشاط القائم على معدل وفيات الوفيات الضعيفة بشكل مثالي للعمل في التركيزات الأعلى لمركبات الاختبار اللازمة للكشف عن هذه المثبطات الأضعف. يمكن للنطاق الديناميكي وتشتت التحول الكيميائي في تجربة NMR بسهولة حل الرنين من الركيزة والمنتج ومركبات الاختبار. وهذا يتناقض مع الاختبارات الطيفية، التي غالباً ما تنشأ فيها مشاكل تداخل القراءة من المركبات ذات الخصائص المتداخلة لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأنها تفتقر إلى الإنزيمات مراسل، واختبارات NMR الإنزيم واحد ليست عرضة للإيجابيات كاذبة مقرونة بالقياس. هذه السمة يجعلها مفيدة كاختبارات متعامدة، تكمل الاختبارات التقليدية عالية الإنتاجية الفحص واختبارات الفرز على مقاعد البدلاء. يتم توفير بروتوكولات مفصلة للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، وفحوصات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها. يتم عرض الأساليب باستخدام اثنين من الإنزيمات الريبوهيدرولاز النوكليوسيد. يظهر استخدام 1H NMR للإنزيم الخاص بالبيورين، في حين يظهر 19F NMR للإنزيم الخاص بالبيريميدين. تنطبق البروتوكولات بشكل عام على أي إنزيم حيث يمكن ملاحظة الركيزة والرنين المنتج وتمييزه بالتحليل الطيفي NMR. لتكون الأكثر فائدة في سياق اكتشاف المخدرات، يجب أن يكون التركيز النهائي للركيزة لا يزيد عن 2-3x قيمة Km. يعتمد اختيار تجربة NMR على تفاعل الانزيم وركائز المتاحة، فضلا عن الأجهزة NMR المتاحة.
Introduction
التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) راسخ لتوصيف ورصد تفاعلات الإنزيم1،2. وتستخدم الاختلافات في التحولات الكيميائية وأنماط اقتران للتمييز بين الركيزة والرنين المنتج، وتستخدم كثافة الرنين النسبي لتحديد مقدار نسبة رد الفعل. ويلاحظ استهلاك الركيزة وابتكار المنتج مباشرة في طيف الـ NMR. وهذا يتناقض مع القياس الطيفي أو التحليل الطيفي للفلور، حيث يشار إلى مسار زمن التفاعل بتغيير في الامتصاص يعزى إلى بعض الأنواع الكيميائية التي يتم استهلاكها أو إنشاؤها. تماما كما هو الحال مع الطرق الأخرى، يمكن استخدام NMR لدراسة ردود فعل الإنزيم كدالة لدرجة الحرارة، ودرجة الألف، أو غيرها من شروط الحل، ويمكن تحديد آثار مثبطات.
في الآونة الأخيرة، تم إثبات فحوصات نشاط الإنزيم القائم على NMR لفحص الشظايا3و4. الاختبارات المستندة إلى NMR هي مناسبة بشكل مثالي للعمل في تركيزات أعلى من مركبات الاختبار (غالباما ما يصل إلى 1 mM) اللازمة للكشف عن هذه المثبطات أضعف. يمكن للنطاق الديناميكي وتشتت التحول الكيميائي في تجربة NMR بسهولة حل الرنين من الركيزة والمنتج ومركبات الاختبار. ويقارن ذلك بشكل إيجابي باختبارات الطيف الطيفي حيث تنشأ مشاكل تداخل القراءة من المركبات ذات التشكيلات الجانبية المتداخلة للامتصاص فوق البنفسجي. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأنها تفتقر إلى الإنزيمات مراسل، واختبارات NMR الإنزيم واحد ليست عرضة للإيجابيات كاذبة مقرونة بالقياس. هذه الميزة يجعلها مفيدة كما الاختبارات متعامدة، واستكمال التقليدية عالية الإنتاجية فحص الاختبارات والفرز على مقاعد البدلاء5.
في مختبر البحوث لدينا، وتستخدم اختبارات النشاط القائم على NMR لتحديد وتقييم مثبطات تريتشوناز المهبلية النوكليوسيد الريبيوهيدرولاز. الطفيلي المهبلي T. يسبب المرض غير الفيروسي ة المنقولة جنسيا ً6. زيادة المقاومة للعلاجات القائمة7 هو الدافع للحاجة إلى علاجات جديدة، آلية القائم، مع الإنزيمات الأساسية مسار الإنقاذ النوكليوسيد تمثل الأهداف الرئيسية8. وقد تم تطوير اختبارات النشاط المستندة إلى NMR لكل من الإنزيمات الخاصة بالبيريميدين والبيورين، والريدين نوكليوسيد ريبوهيدرولاز (UNH)9، والأدينوسين / غوانوزين مفضلا النوكليوسيد ريبوهيدرولاز (AGNH)10. وترد ردود الفعل التي حفزت من قبل هذه الإنزيمات اثنين في الشكل 1. وتستخدم الاختبارات NMR لفحص مكتبات أجزاء لنقاط البداية الكيميائية، وتحديد قيم IC50، والازهاتمن مثبطات ربط التجميع أو التكافؤ 11 . ويجري أيضا ترجمة نفس الاختبارات لتقييم نشاط الإنزيم في الخلايا كلها12.
يتم توفير بروتوكولات مفصلة للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، وفحوصات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها. تنطبق البروتوكولات بشكل عام على أي إنزيم يمكن أن يلاحظ فيه الركيزة والرنين المنتج ويميزه التحليل الطيفي NMR. وقد وضعت ثلاثة افتراضات للبساطة. أولاً، لم يتم تحديد الركيزة. وبالنسبة لفحوصات الأنشطة القائمة على معدل الوفيات الثلاثة لكي تكون مفيدة، ينبغي ألا يزيد التركيز النهائي للركيزة عن 2-3 x قيمة Km 4. في الأمثلة المعروضة، التركيزات النهائية من الأدينوسين و 5-فلورورين هو 100 ميكرومتر (ك = 54 ميكرومتر) و 50 ميكرومتر (ك = 15 ميكروم)، على التوالي. في البروتوكولات، وتحقيق هذه التركيزات يتوافق مع 12 μL من 5 m الأدينوسين أو 12 ميكرولتر من 2.5 mM 5-fluorouridine.
ثانياً، تم اختيار كمية الإنزيم المنصوص عليها في البروتوكولات، 5 μL، لتتوافق مع المبلغ المطلوب لينتج عن تحويل الركيزة إلى منتج بنسبة 75% تقريبًا في 30 دقيقة. هذه الكمية تمثل عادة تخفيفكبير من مخزون الإنزيم النقي، ويجب تحديد التخفيف مقدما لكل إنزيم. يتم تخزين حلول الإنزيم المنقي AGNH وUNH عند -80 درجة مئوية في الأليقوات التي توفر ما يكفي من الإنزيم لعدة آلاف من ردود الفعل. وبالتالي، فإن عامل التخفيف من الناحية المثالية يحتاج فقط إلى تحديد أو التحقق من صحته كل بضعة أشهر. ثالثاً، لم يتم تحديد تجربة NMR 1D المحددة. في النتائج التمثيلية، يظهر معدل1 H NMR لAGNH10 ويظهر 19F NMR لUNH9، مع تجربة NMR المذكورة في المراجع المقابلة. يعتمد اختيار تجربة NMR على تفاعل الانزيم وركائز المتاحة، فضلا عن الأجهزة NMR المتاحة. وأخيراً، تجدر الإشارة إلى أن النهج التجريبي الموصوف لا يلتزم بالمتطلبات الصارمة للمعدل الكمّي (QNMR)13,14. في البروتوكول، يتم تحديد رد فعل النسبة المئوية باستخدام التغيرات النسبية في كثافة نفس الرنين في كل طيف، بدلا من تحديد التركيزات المطلقة. هذا النهج يلغي الحاجة إلى الحصول على البيانات وتعديلات المعالجة، فضلا عن المعايير الداخلية أو الخارجية، التي هي مطلوبة لqNMR.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكولات الموصوفة تنطبق عموما على العديد من الإنزيمات، شريطة أن تكون للركائز و/أو المنتجات إشارات قابلة للحل في طيف NMR. ومع ذلك، من الأهمية بمكان أن يكون تركيز الركيزة قريباً من قيمة Km وعالية بما يكفي للكشف في تجربة NMR ضمن إطار زمني معقول. تركيز الركيزة لا يزيد عن 2-3x قيمةM</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور دين براون على توفير مركبات من مكتبة أجزاء استرازينيكا والدكتور ديفيد باركين على توفير انزيمات AGNH و UNH. وقد تم دعم البحوث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية للمعاهد الوطنية للصحة بموجب جائزة رقم R15AI128585 إلى B. J. S. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.كما تم دعم البحوث من قبل هوراس G. ماكدونيل زمالة البحوث الصيفية منحت لS. N. M., عائلة لاندسبرغ زمالة منحت لجي أ. ج.، ومنحة تطوير أعضاء هيئة التدريس وجائزة فريدريك بيتلهايم للأبحاث من جامعة أدلفي إلى ب. ج.
Materials
| AGNH | Purified in-house | N/A | TVAG_213720 |
| UNH | Purified in-house | N/A | TVAG_092730 |
| Adenosine | Sigma | A9251 | |
| 5-Fluorouridine | Sigma | F5130 | |
| Dimethyl sulfoxide-D6 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99.9% |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Deuterium oxide | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99.9% |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144212 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99.5% |
| Pipette | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| Pipette | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| Pipette | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Conical tubes | Corning | 352099 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02215365 | |
| NMR tubes | Norell | 502-7 | Or as appropriate for the NMR |
| NMR spectrometer | Bruker | N/A | AvanceIII500 |
| Prism software | GraphPad | N/A | Version 5.04 |
References
- Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. . NMR in Molecular Biology. , (1981).
- Evans, J. N. S. . Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).
- Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
- Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
- Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
- Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
- Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
- Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
- Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
- Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
- Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
- Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
- Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
- Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
- Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
- Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
- Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
- Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
- Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
- Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
- Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
- Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).
