NMR-based activiteit assays voor het bepalen van samengestelde remming, IC₅₀ waarden, artefactuele activiteit, en de hele cel activiteit van nucleoside Ribohydrolases

De kern magnetische resonantie (NMR) de spectroscopie is goed-gevestigd voor het kenmerken van en het controleren van enzymreacties^1,2. Verschillen in chemische verschuivingen en koppelings patronen worden gebruikt om substraat en product resonanties te onderscheiden, en relatieve resonantie intensiteiten worden gebruikt om het percentage van de reactie te kwantificeren. Zowel de consumptie van substraat als de creatie van het product worden direct waargenomen in het NMR-spectrum. Dit contrasteert met spectrofotometrie of de spectroscopie van de fluorescentie, waarin de reactietijd cursus door een verandering in absorptie wordt vermeld toe te schrijven aan sommige chemische soorten die worden verbruikt of worden gecreërd. Net als bij de andere methoden kan NMR worden gebruikt om enzymreacties te bestuderen als functie van temperatuur, pH of andere oplossings omstandigheden, en de effecten van remmers kunnen worden bepaald.

Meer recentelijk, NMR-based enzymactiviteit assays zijn aangetoond voor fragment screening^3,4. NMR-gebaseerde assays zijn bij uitstek geschikt om te werken bij de hogere concentraties van test verbindingen (vaak zo hoog als 1 mM) die nodig zijn om deze zwakkere remmers te detecteren. Het dynamisch bereik en de chemische verschuivings dispersie in het NMR-experiment kunnen gemakkelijk resonanties van substraat, product en test verbindingen oplossen. Dit vergelijkt gunstig aan spectrofotometrische analyses waar read-out interferentie problemen vaak voortkomen uit verbindingen met overlappende UV-VIS absorptie profielen. Bovendien aangezien zij verslaggever enzymen ontbreken, zijn de enig-enzym NMR-analyses niet naar voren gebogen aan gekoppelde-assay valse positieven. Dit voordeel maakt ze nuttig als orthogonale assays, een aanvulling op de traditionele high throughput screeningtests en Benchtop triage assays⁵.

In ons onderzoekslaboratorium worden NMR-based activiteit assays gebruikt voor het identificeren en evalueren van inhibitoren van Trichomonas vaginais nucleoside ribohydrolases. De T. vaginais parasiet veroorzaakt de meest voorkomende niet-virale seksueel overdraagbare aandoening⁶. Toenemende weerstand tegen bestaande therapieën⁷ is het besturen van de behoefte aan nieuwe, mechanisme-gebaseerde behandelingen, met essentiële nucleoside Salvage pathway enzymen die Prime doelen⁸. NMR-based activiteit assays zijn ontwikkeld voor zowel pyrimidine-en purine-specifieke enzymen, Uridine nucleoside ribohydrolase (UNH)⁹, en adenosine/Guanosine voorkeur nucleoside RIBOHYDROLASE (AGNH)¹⁰. De reacties die door deze twee enzymen worden gekatalyseert, worden weergegeven in Figuur 1. De NMR-assays worden gebruikt om fragment bibliotheken voor chemische uitgangspunten te screenen, te bepalen IC₅₀ waarden, en onkruid uit aggregatie-based of covalente bindende remmers¹¹. De zelfde analyses worden ook vertaald om enzymactiviteit in gehele cellen¹²te beoordelen.

De gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor aanvankelijke samenstellings analyses bij 500 μM en 250 μM, dosis-reactie analyses voor het bepalen van IC₅₀ waarden, detergent tegen het scherm analyses, sprong-verdunnings tegen het scherm analyses, en analyses in de gehele cellen van E. coli . De protocollen zijn over het algemeen van toepassing op elk enzym waarin substraat en product resonanties kunnen worden waargenomen en onderscheiden door NMR spectroscopie. Drie veronderstellingen zijn gemaakt voor eenvoud. Eerst wordt het substraat niet gespecificeerd. Voor NMR-gebaseerde activiteit assays om nuttig te zijn, de uiteindelijke concentratie van substraat mag niet meer dan 2-3x de K_m waarde⁴. In de getoonde voorbeelden, de uiteindelijke concentraties van adenosine en 5-fluorouridine zijn 100 μM (k_m = 54 μM) en 50 μm (k_m = 15 μm), respectievelijk. In de protocollen komt het bereiken van deze concentraties overeen met 12 l van 5 mM adenosine of 12 l van 2,5 mM 5-fluorouridine.

Ten tweede, de hoeveelheid enzym die in de protocollen, 5 l, is gekozen om te corresponderen met het bedrag dat nodig is om te resulteren in ongeveer 75% conversie van substraat naar product in 30 min. Deze hoeveelheid vertegenwoordigt meestal een grote verdunning van een gezuiverd enzym voorraad, en de verdunning moet vooraf worden vastgesteld voor elk enzym. Gezuiverd AGNH en UNH enzym voorraadoplossingen worden opgeslagen bij-80 °C in fracties die genoeg enzym voor verscheidene duizend reacties verstrekken. Zo, de verdunningsfactor idealiter alleen moet worden bepaald of gevalideerd om de paar maanden. Ten derde is het specifieke 1D NMR-experiment niet gespecificeerd. In de representatieve resultaten wordt ¹H NMR getoond voor AGNH¹⁰ en ¹⁹F NMR wordt getoond voor UNH⁹, met het NMR-experiment beschreven in de overeenkomstige referenties. De keus van NMR experiment hangt van de enzym reactie en de beschikbare substraten evenals de beschikbare NMR instrumentatie af. Ten slotte moet worden opgemerkt dat de experimentele aanpak beschreven niet voldoet aan de strikte eisen van kwantitatieve NMR (qNMR)^13,14. In het protocol wordt een procent reactie bepaald aan de hand van de relatieve veranderingen in intensiteit van dezelfde resonantie in elk spectrum, in plaats van door absolute concentraties te bepalen. Deze aanpak elimineert de noodzaak voor data-acquisitie en verwerking van wijzigingen, alsmede interne of externe normen, die nodig zijn voor qNMR.