비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 최근 작업에서, 이러한 결합은 가역 적 번역 후 변형으로 분류 되었으며, 시스테인 기반 “산화 환 원 스위치”로 작용 하 여 단백질 기능, 위치 및 상호작용의 변조를 허용 하는^{1,2, 3,4}. 따라서,이 수정을 연구 할 수 있는 것이 중요 합니다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해⁵. SDS-PAGE 분석은 많은 실험실에서 사용 되는 기술로, 결과를 신속 하 고 쉽게 분석 하 고 최소한의 비용으로 해석 할 수 있으며 질량 분석기와 같은 이황화 물 결합을 식별 하는 데 사용 되는 다른 기술 보다 유리 합니다^{6 ,7} 및 원형 중 크롬 산⁸.

이 방법이 연구에 도움을 주는 적절 한 기술 인지 결정 하는 한 가지 중요 한 단계는 시스테인 잔기 (들)이 존재 하는 것을 보장 하기 위해 관심 있는 단백질의 일차 서 열을 철저히 조사 하는 것 이다. 또 다른 유용한 단계는 게시 된 임의의 이전 결정 구조를 연구 하거나 생물 정보학 응용 프로그램을 사용 하 여 관심 있는 단백질의 3 차원 구조를 탐구 하 여 시스테인 잔기 (들)가 위치할 수 있는 곳을 가시화 하는 것 이다. 잔류물 (들)이 외부 표면 상에 존재 하는 경우에는 상기 구조의 내부에 묻혀 있는 시스테인 잔기가 아닌 이황화 결합을 형성 하는 것이 더 좋은 후보가 될 수 있다. 그러나 단백질이 기질 상호 작용 또는 단백질-단백질 상호작용에 따라 구조적 변화를 겪을 수 있으므로 이러한 잔류 물이 환경에 노출 될 수도 있다는 점에 유의 해야 합니다.

확인 된 다이 성체 복합체는 포름알데히드를 사용 하 여 화학적 가교 결합으로 확인 될 수 있다. 포름알데히드는 높은 세포 투과성 및 짧은 가교 범위에 기인한이 검증 기술에 대 한 이상적인 교차 링커입니다 ~ 2-3 Å, 특정 단백질-단백질 상호작용의 검출을 보장 하는^9,10. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS¹¹로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다. 그러나,이 프로토콜은 그밖 세포 선, 조직 및 유기 체를 위해 적응 될 수 있습니다.