Summary

Combinaison de l’analyse SDS-PAGE non réductrice et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères dans la culture

Published: May 02, 2019
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Summary

Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Une méthode simple pour analyser les complexes multimères stabilisés par ces liaisons est une analyse SDS-PAGE non réductrice. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS.

Abstract

Les structures de nombreuses protéines sont stabilisées par des liaisons disulfures covalentes. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-traductionnelle. Ainsi, il est important de pouvoir étudier cette modification dans les cellules vivantes. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est par une méthode en deux étapes d’analyse SDS-PAGE non réductrice et de réticulation du formaldéhyde. Cette méthode en deux étapes est avantageuse comme première étape pour découvrir les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures en raison de sa facilité technique et de son faible coût de fonctionnement. Ici, la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS est utilisée pour illustrer cette méthode en analysant spécifiquement l’isoforme nucléaire de dUTPase.

Introduction

Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-translationnelle réversible, agissant comme un “commutateur redox” à base de cystéine permettant la modulation de la fonction de protéine, de l’emplacement et de l’interaction1,2, 3,4. Il est donc important de pouvoir étudier cette modification. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est de ne pas réduire l’analyse SDS-PAGE5. L’analyse SDS-PAGE est une technique utilisée dans de nombreux laboratoires, où les résultats peuvent être obtenus et interprétés rapidement, facilement et avec des coûts minimes, et est avantageux par rapport aux autres techniques utilisées pour identifier les liaisons disulfure telles que la spectrométrie de masse6 ,7 et dichroïsme circulaire8.

Une étape importante pour déterminer si cette méthode est une technique appropriée pour aider dans une étude est d’examiner attentivement la séquence primaire de la protéine d’intérêt pour s’assurer qu’il y a des résidus de cystéine (s) présents. Une autre étape utile est de rechercher toutes les structures cristallines précédentes publiées ou d’utiliser une application de bioinformatique pour explorer la structure tridimensionnelle de la protéine d’intérêt pour visualiser où le résidu de cystéine (s) peut être localisé. Si le ou les résidus sont présents sur la surface extérieure, il peut être préférable de former un lien disulfure plutôt qu’un résidu de cystéine enterré à l’intérieur de la structure. Cependant, il est important de noter que les protéines peuvent subir des changements structurels sur des interactions de substrat ou des interactions protéine-protéine permettant à ces résidus d’être alors exposés à l’environnement aussi bien.

Les complexes multimères identifiés peuvent ensuite être vérifiés avec un réticulation chimique à l’aide de formaldéhyde. Le formaldéhyde est un lien de croisement idéal pour cette technique de vérification en raison de la perméabilité cellulaire élevée et de la courte portée croisée de ~ 2-3 Å, assurant la détection d’interactions protéine-protéine spécifiques9,10. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS11. Cependant, ce protocole peut être adapté pour d’autres lignées cellulaires, tissus et organismes.

Protocol

1. blocage des résidus de cystéine libres à l’aide d’iodoacétamide Cultiver des cellules OS U-2 dans un plat de 6 cm2 à 50% – 60% de Confluences dans un milieu essentiel minimum avec un taux élevé de glucose contenant 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pyruvate de sodium à 37 ° c dans 5% co2. Faire un nouveau stock de 10 mM d’iodoacétamide juste avant l’utilisation, puis jeter tout réactif inutilisé. Ajouter l’iodoacétamide de concentration fin…

Representative Results

La dUTPase nucléaire forme une liaison disulfure intermoléculaire formant une configuration dimère stable grâce à l’interaction de deux résidus de cystéine positionnés au troisième acide aminé de chaque protéine monomère11. Ceci est démontré dans la figure 1a, B. Pour s’assurer que cette liaison disulfure n’était pas une interaction non spécifique en raison d’anomalies de la migration dans l’e…

Discussion

La méthode décrite ici donne un protocole direct pour l’analyse des complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures. Ce protocole peut facilement être adapté à d’autres lignées de culture cellulaire, des tissus et des organismes permettant une large gamme d’applications.

Une étape importante dans cette procédure est de s’assurer que les liaisons disulfure ne sont pas une conséquence de la procédure d’extraction. Tous les résidus de cystéine libre peuvent êt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous apprécions avec gratitude les efforts déployés par le Dr Jennifer Fischer pour la purification de l’anticorps polyclonaux dUTPase et Kerri Ciccaglione pour tous ses efforts pour aider à éditer ce manuscrit. Cette recherche a été partiellement appuyée par une subvention de la New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18).

Materials

16% precast TGX gels ThermoFisher Xp00160
175 cm2 Flask Cell star 658175
18CO ATCC CRL-1459
6 cm2 dish VWR 10861-588
A549 ATCC CCL-185
Amersham ECL detection kit GE 16817200
Blot transfer apparatus Biorad 153BR76789
BME Sigma Aldrich M3148
Bradford protein reagent Biorad 5000006
Bromophenol Blue
BSA Cell signaling 99985
Cell lysis buffer Cell signaling 9803
Centrifuge Eppendor 5415D
DMEM Gibco 11330-032
Drill
EDTA Sigma Aldrich M101
Electrophoresis apparatus Invitrogen A25977
Extra thick western blotting paper ThermoFisher 88610
Fetal bovine serum Gibco 1932693
Formaldehyde ThermoFisher 28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol Sigma Aldrich 65516
Glycine RPI 636050
Heat block Denville 10285-D
Hepes Sigma Aldrich H0527
Hydrochloric acid VWR 2018010431
Iodoacetamide ThermoFisher 90034
Kimwipe Kimtech 34155
Methanol Pharmco 339000000
Non-fat dry milk Cell signaling 99995
PBS Sigma Aldrich P3813
PMSF Sigma Aldrich 329-98-6
Posi-click tube Denville C2170
Power supply Biorad 200120
Prestained marker ThermoFisher 26619
PVDF membrane Biorad 162-0177
Rocker Reliable Scientific 55
Saos2 ATCC HTB-85
SDS Biorad 161-0302
Secondary antibody Cell signaling 70748
Small cell scraper Tygon S-50HL class VI
Sodium chloride RPI S23020
Sodium pyruvate Gibco
Sonicator Branson 450
Sponge pad for blotting Invitrogen E19051
Stir plate Corning PC353
Sucrose Sigma Aldrich S-1888
Tris Base RPI T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 Sigma Aldrich SRE0031
Tris-Glycine running buffer VWR J61006
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
U-2 OS ATCC HTB-96
X-ray film ThermoFisher 34090

References

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  2. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
  3. Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
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Cite This Article
Rotoli, S. M., Caradonna, S. J. Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture. J. Vis. Exp. (147), e59483, doi:10.3791/59483 (2019).

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