Summary

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Published: April 19, 2019
doi:

Summary

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Abstract

Hücre proteomes kez Elektroforez deneyleri, nerede proteinler hücrelerdeki tüm türlerin özellikle sigara floresan bir boya ile etiketlenir ve ayırma takip photodetector tarafından fark kullanarak karakterizedir. Tek molekül Floresans görüntüleme NEMS protein algılama bireysel floresan moleküllerin görüntülenmesi için onun yetenek sağlayabilir. Ancak, bu güçlü görüntüleme yöntemi uygulamaya Elektroforez deneyleri floresan her protein türleri arasında Proteom etiketleme homojenliği karakterize için yollar eksikliği ile engel oluyor. Burada, bir tek molekül Floresans görüntüleme tahlil dayalı Proteom genelinde etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir yöntem geliştirdi. Bir HeLa hücre örnek, biz ‘doluluk etiketleme’ olarak adlandırdığı en az bir boya ile etiketli protein oranı kullanarak bizim ölçüm (LO), Aralık için uygulamanın tek molekül görüntüleme için yüksek potansiyel destekleyen %90 %50 belirlendi duyarlı ve hassas Proteom analizleri.

Introduction

Protein molekülleri hücre içinde ifade kümesinin tamamını ölçmek için amaçlayan Proteom analizleri, mevcut biyolojik ve tıbbi çalışmalar değerli bir yaklaşımdır. Bu analizin yaygın spectra protein iyonlaşma1,2,3ile oluşturulan temel protein türü tanımlar kütle spektrometresi kullanır. Elektroforez, polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) dahil olmak üzere, Kapiler Elektroforez ve iki boyutlu (2D) Jel Elektroforez Proteom analizler için alternatif bir yöntem olduğunu. Bu yöntem belirsiz floresan elektroforetik ayrımı ve algılama ve miktar her protein türlerin takip analiz hücrelerdeki tüm protein molekülleri etiketlerine göre üzerinde dayanır. Gerekli non-spesifik protein etiketleme elde etmek için bir strateji proteinler Coomassie mavi ve Sypro Ruby4,gibi5,6 Elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler yoluyla bağlayabilirsiniz floresan boyalar kullanmaktır . N-hydroxysuccinimide (NHS) ester veya hangi kovalent proteinler Birincil aminler ve thiols gibi ortak artıkları ile bağlayabilirsiniz, maleimide, sırasıyla7, içeren boya ile kovalent etiketleme kullanmak için alternatif bir stratejidir 8.

Bu arada, Floresans algılama hassasiyeti düşük-bereket proteinler ve az sayıda hücre analiz etmek için idealdir. Tek molekül Floresans görüntüleme bireysel floresan boyalar ve in vitro ve içinde vivo9,10,11,12etiketli proteinler algılanmasını sağlayan en önemli yöntemlerinden biridir, 13,14,15. Bu görüntüleme yönteminin uygulamaya Proteom Elektroforez tabanlı analiz bireysel fluorescently etiketli protein sayımı tarafından son derece hassas ve kantitatif testleri etkinleştirmek için bekleniyor. Ancak, bu floresan boyalar ile etiketleme tüm protein molekülleri yeterince homojen olup olmadığı ve nasıl bu homojenliği farklı protein türler (şekil 1) tarafından etkilenir belirsizdir. Basit toplu çözüm ölçümleri8 ‘verimlilik kaplin’ veya ‘verimlilik etiketleme’ denilen proteinlere floresan boyalar molar oranı elde etmek için kullanılabilir, ancak bu özellik arasında etiketleme homojenliği ilgili bilgi sağlamaz protein molekülleri.

Burada, biz tüm protein türleri16hücre (Şekil 2) için etiketleme homojenliği araştırmak bir tahlil için protokol tanımlamak. Bu testin iki anahtar adım protein saflaştırma ve görüntüleme vardır. İlk adımda, hücrelerdeki tüm proteinler fluorescently etiketlenir ve biotinylated sonra ayrı ayrı Jel Elektroforez kullanarak ayıklanır, electroelution tarafından takip. İkinci adımda, ayıklanan örneklerinde bireysel protein, Floresans özelliklerini tek molekül görüntüleme üzerinde göre değerlendirilir. Bu veri, parametreleri gibi proteinler yüzdesi ile en azından bir tane etiketli sayım çözümleme için önemli boya, hangi etiketleme doluluk (LO)16dediğimiz ve floresan boyalar ortalama sayısı bir tek protein molekülüne bağlı ( boya), karakterize edilebilir. İletişim kuralı ‘ HeLa hücre Proteom NHS ester tabanlı siyanür 3 (Cy3) boya ile etiketleme için en iyi duruma getirilmiş bir yordam bir örnek olarak sunulur ve istenen araştırma hedeflerine göre etiketleme diğer yordamlar ile değiştirilebilir.

Protocol

1. hücre hazırlık HeLa hücreleri 37 ° C’de 10 cm tabak içinde yetiştirmek altında %5 CO2 ‘ Dulbecco’nın modifiye kartal orta % 10 fetal sığır serum içeren. % 70 confluency, ATCC yönergeleri17takip alabilirseniz katlanarak büyüyen hücreleri toplamak. 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) (pH 7,4) x 5 mL hücrelerle durulayın. PBS kaldırın. 1 mL %0.1 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin. 37 ° C’de 5 dk kuluçkaya <…

Representative Results

Şekil 4 ham görüntü verilerine HeLa hücre lysate proteinlerin farklı molekül ağırlığı kesirler için hem de pozitif ve negatif Denetim temsil eder. Sergi 100-500 noktalar resim başına protein örnek ve pozitif kontrol, negatif kontrol yok veya birkaç noktalar, protokol yeterince coverslip yüzeye boyalar spesifik olmayan bağlama engeller gösterilen görüntüler. Nokta yoğunluğu histogramlar protein örnekleri ve olumlu denetim boyalar Stok…

Discussion

Bu kağıt ayırma SDS-sayfa (Adım 3) ile sonra etiketleme homojenliği hücrelerdeki her etiketli protein türlerin ölçmek için bir protokol açıklar. Ayırma yöntemi ayrılık ve ayırma proteinlerin yüksek çözünürlüklü, özel ekipman23gerektiren süre izin sıvı Kromatografi veya kapiller Elektroforez, gibi diğer yöntemleri ile yedek olabilir. NHS-ester içinde geçerli protokolü kullanılarak etiketleme yöntemi maleimide-ester veya antikorlar, örneğin kullanarak diğer yön…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Masae Ohno ve Kazuya Nishimura deneysel yardım ve tavsiye için teşekkür ederiz. Bu eser PRESTO (JPMJPR15F7), Japonya bilim ve teknoloji ajansı, genç bilim adamları (A) (24687022), araştırmacı araştırma (26650055) zorlu ve yenilikçi alanlara (23115005), Japonya Derneği bilimsel araştırma için Grants-in-aid tarafından desteklenmiştir Bilim ve hibe Takeda Bilim Vakfı ve Mochida Anıtı Vakfı tarafından promosyon Medikal ve ilaç araştırma için. S.L. RIKEN Uluslararası Program ilişkilendirmek (IPA) programından destek kabul eder.

Materials

22x22x0.15 mm coverslip VWR 470019-004
488 nm Argon laser Coherent Innova 70C
488 nm dichroic mirror Semrock FF495-Di03
488 nm emission filter Semrock FF02-520/28
560 nm dichroic filter Semrock Di02-R561
560 nm emission filter Semrock FF02-617/73
560 nm fiber laser MBP Communications F-04306-2
60x oil immersion lens Olympus PLAPON 60x
Avidin Nacalai-tesque 03553-64
Biotin-PEG-amine Thermo Scientific 21346
Biotinylated Alexa Fluor 488 Nanocs
Borate Nacalai-tesque
BSA Sigma-Aldrich A9547
CHAPS Dojindo C008-10
Cy3 NHS-ester dye GE Healthcare PA13101
Dialyzer  – D-tube, 6-8 kDa Merck Millipore 71507-M
DMEM Sigma-Aldrich
DTT Nacalai-tesque 14112-94
EDC Nacalai-tesque
EMCCD camera Andor IiXon 897
Epi fluorescence microscope Olympus IX81
Gel viewer GE Healthcare ImageQuant LAS 4000
Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix Gibco
Plasma cleaner Diener Electronic
SDS Wako NC0792960
Size purification column 10K Merck Millipore UFC5010
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416

References

  1. Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
  2. Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
  3. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  4. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
  5. Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
  6. Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
  7. Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
  8. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
  9. Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
  10. Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
  11. Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
  12. Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
  13. Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
  14. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  15. Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
  16. Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
  17. Ian Freshney, R. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).
  18. Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
  19. Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
  20. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  21. Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
  22. Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
  23. Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
  24. Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
  25. Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
  26. Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).

Play Video

Cite This Article
Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level. J. Vis. Exp. (146), e59199, doi:10.3791/59199 (2019).

View Video