Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul
Summary
Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.
Abstract
Cel proteomes worden vaak gekenmerkt met behulp van elektroforese testen, waar alle soorten eiwitten in de cellen worden niet-specifiek aangeduid met een fluorescente kleurstof en zijn gespot door een foto-elektrische cel na hun scheiding. Enkel molecuul fluorescentie imaging kan voorzien haar vermogen voor het visualiseren van individuele fluorescerende moleculen ultrasensitive eiwit detectie. De toepassing van deze krachtige imaging methode voor elektroforese bepalingen wordt echter belemmerd door het gebrek aan manieren om de homogeniteit van het fluorescerende labeling van elke soort eiwit over de Proteoom karakteriseren. Hier, wij een methode ontwikkeld om de labeling homogeniteit het proteoom op basis van een enkel molecuul fluorescentie imaging assay evalueren. In onze meting met behulp van een steekproef van HeLa cel, het aandeel van eiwitten, aangeduid met ten minste één kleurstof, die we genoemd ‘labelen bezetting’ (LO), was vastbesloten om bereik van 50% tot 90%, ter ondersteuning van het grote potentieel van de toepassing van één molecuul imaging te gevoelige en nauwkeurige Proteoom-analyse.
Introduction
Proteoom analyse, die is gericht op het kwantificeren van de hele set van eiwitmolecules uitgedrukt in de cel, is een waardevolle benadering in huidige biologische en medische studies. Deze analyse is vaak afhankelijk van de Spectrometrie van de massa, waarmee eiwit soorten op basis van spectra gegenereerd door eiwit ionisatie1,2,3. Een alternatieve methode voor proteoom-analyse is elektroforese, met inbegrip van polyacrylamide gelelektroforese (pagina), capillaire elektroforese en tweedimensionale (2D) gelelektroforese. Deze methode is afhankelijk van de aspecifieke fluorescerende etikettering van alle de eiwitmolecules in de geanalyseerde cellen, gevolgd door elektroforetische scheiding en opsporing en kwantificering van elke soort eiwit. Om te bereiken dat de vereiste aspecifieke eiwit labeling, is een strategie het gebruik van fluorescente kleurstoffen die aan eiwitten via elektrostatische en hydrofobe interacties, zoals Coomassie Blue en Sypro-Ruby4,5,6 binden kunnen . Een alternatieve strategie is het gebruik van covalente labelen met kleurstoffen met N-hydroxysuccinimide (NHS) ester- of maleimide, die covalent aan eiwitten door middel van gemeenschappelijke residuen zoals primaire amines en thiolen binden kan, respectievelijk7, 8.
Ondertussen, de gevoeligheid van de fluorescentie detectie is ideaal voor het analyseren van lage-overvloed eiwitten en kleine aantallen cellen. Enkel molecuul fluorescentie imaging is één van de meest gevoelige methodes waarmee de detectie van individuele fluorescente kleurstoffen en gelabelde proteïnen in vitro en in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Toepassing van deze beeldvorming methode elektroforese gebaseerde Proteoom analyse wordt verwacht om zeer gevoelige en kwantitatieve tests door het tellen van afzonderlijke fluorescently gelabelde proteïnen. Het blijft echter onduidelijk of labelen met fluorescente kleurstoffen is homogeen genoeg over alle de eiwitmolecules, en hoe deze homogeniteit wordt beïnvloed door verschillende eiwit soorten (Figuur 1). Eenvoudige bulk oplossing metingen kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van een molaire ratio van fluorescente kleurstoffen aan eiwitten ‘koppeling efficiëntie’8 of ‘labelen efficiëntie’ genoemd, maar deze eigenschap biedt geen informatie op de homogeniteit van de etikettering onder eiwitmolecules.
Hier beschrijven we het protocol voor een bepaling te onderzoeken de labeling homogeniteit voor alle soorten van de eiwitten in de cel (Figuur 2)16. De twee belangrijkste stappen van deze bepaling zijn EiwitReiniging en beeldvorming. In de eerste stap, alle van de eiwitten in de cellen worden fluorescently aangeduid en biotinyleerd, vervolgens uitgepakt afzonderlijk met behulp van gelelektroforese gevolgd door electroelution. In de tweede stap, worden fluorescentie-eigenschappen van individuele eiwitmolecules in de uitgepakte monsters geëvalueerd op basis van één molecuul imaging. Van deze gegevens, parameters die belangrijk zijn voor het tellen analyse, zoals het percentage eiwitten aangeduid met ten minste een kleurstof, die wij noemen labeling bezetting (LO)16, en het gemiddelde aantal fluorescente kleurstoffen gebonden aan een molecule één eiwit (n̄ kleurstof), kan worden gekarakteriseerd. In het protocol, een geoptimaliseerde procedure voor het labelen van de HeLa cel Proteoom met NHS ester gebaseerde Cyanine 3 (Cy3) kleurstof wordt gepresenteerd als een voorbeeld, en kan worden aangepast met andere labeling procedures volgens onderzoek van de gewenste doelstellingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit witboek beschrijft een protocol om te kwantificeren van de labeling homogeniteit van elke soort gelabelde proteïnen in cellen na scheiding met SDS-pagina (stap 3). De methode van scheiding kan met andere methoden, zoals vloeibare chromatografie of capillaire elektroforese, waarmee scheiding en versplintering van cellulaire eiwitten met een hoge resolutie, terwijl het vereisen van speciale apparatuur23worden vervangen. De labeling methode met behulp van NHS-ester in het huidige protocol kan wo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Masae Ohno en Kazuya Nishimura voor experimentele hulp en advies. Dit werk werd gesteund door PRESTO (JPMJPR15F7), Japan-Science and Technology Agency, Grants-in-aid voor jonge wetenschappers (A) (24687022), uitdagende verkennend onderzoek (26650055) en wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (23115005), Japan Society for de bevordering van wetenschap, en door subsidies van de Takeda Science Foundation en de Mochida Memorial Foundation voor medische en farmaceutische Research. S.L. erkent ondersteuning vanuit de RIKEN International-programma koppelen (IPA) programma.
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
