تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تجانس وضع العلامات لكل أنواع البروتين في عينة بروتين معقدة على مستوى جزيء واحد.
Abstract
غالباً ما تتصف بروتيوميس الخلية باستخدام فحوصات التفريد، حيث جميع الأنواع من البروتينات في الخلايا المسماة غير تحديداً مع صبغة فلورسنت ورصدت قبل فوتوديتيكتور بعد انفصالهما. تصوير fluorescence جزيء واحد يمكن أن توفر البروتين أولتراسينسيتيفي الكشف عن قدرته على تصور الأفراد الفلورسنت الجزيئات. ومع ذلك، تطبيق هذا الأسلوب التصوير قوية لفحوصات التفريد يعوقها الافتقار إلى سبل لتوصيف تجانس الفلورسنت وسم كل أنواع البروتين عبر البروتين. هنا، قمنا بتطوير أسلوب لتقييم تجانس وضع العلامات عبر البروتين استناداً مقايسة تصوير fluorescence جزيء واحد. لدينا قياس استخدام عينة خلية هيلا، نسبة البروتينات المسماة بصبغ واحد على الأقل، مما يمكننا وصف ‘وسم شغل’ (لو)، مصممة على مجموعة من 50% إلى 90%، إمكانات عالية لتطبيق تصوير جزيء واحد لدعم تحليل البروتين حساسة ودقيقة.
Introduction
تحليل البروتين، الذي يهدف إلى تحديد المجموعة من الجزيئات البروتينية التي أعرب عنها في الخلية بأكملها، ونهج قيمة في الدراسات البيولوجية والطبية الحالية. عادة يعتمد هذا التحليل على الكتلي، الذي يحدد أنواع البروتين استناداً إلى الأطياف التي تم إنشاؤها عن طريق البروتين التأين1،،من23. هو أسلوب بديل لتحليل البروتين الكهربي، بما في ذلك جل polyacrylamide التفريد (صفحة)، والتفريد الشعرية والتفريد هلام ثنائي الأبعاد (2D). يعتمد هذا الأسلوب على وضع العلامات الفلورية غير محددة من جميع جزيئات البروتين في خلايا تم تحليلها، يليها فصل الغرواني الكهربي والكشف والتحديد الكمي لكل أنواع البروتين. لتحقيق العلامات المطلوبة غير محددة البروتين، هو استراتيجية واحدة لاستخدام الأصباغ الفلورية الذي يمكن ربطه بالبروتينات عن طريق التفاعلات الكهرباء والماء، مثل أخذ الأزرق وسيبرو-روبي4،5،6 . هو استراتيجية بديلة لاستخدام التساهمي وسم مع الأصباغ التي تحتوي على إستر N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) أو ماليميدي، الذي يمكن ربط تساهمي البروتينات عن طريق المخلفات الشائعة مثل الأمينات الأولية وثيولس، على التوالي7، 8.
ومن ناحية أخرى، حساسية الكشف عن الأسفار مثالي لتحليل البروتينات المنخفضة-وفرة وعدد قليل من الخلايا. تصوير fluorescence جزيء واحد هو واحد من الأساليب الأكثر حساسية التي تتيح الكشف عن الأصباغ الفلورية الفردية والبروتينات المسمى في المختبر و المجراة في9،10،،من1112، 13،،من1415. ومن المتوقع تطبيق هذا الأسلوب التصوير للتحليل القائم على التفريد البروتين لتمكين فحوصات حساسة للغاية والكمية عن طريق العد الفردي البروتينات المسماة فلوريسسينتلي. ومع ذلك، فإنه لا يزال غير واضح ما إذا كان وضع العلامات مع الأصباغ الفلورية متجانسة ما يكفي عبر جميع جزيئات البروتين، وكيف يتأثر هذا التجانس في الأنواع المختلفة من البروتين (الشكل 1). قياسات حل غالبية بسيطة يمكن استخدامها للحصول على نسبة مولى من الأصباغ الفلورية للبروتينات التي تسمى ‘اقتران الكفاءة’8 أو ‘وسم الكفاءة’، ولكن هذه الخاصية لا توفر المعلومات على التجانس بين العلامات جزيئات البروتين.
هنا، يمكننا وصف البروتوكول المتعلق فحص للتحقيق في تجانس وضع العلامات لجميع أنواع البروتين في الخلية (الشكل 2)16. الخطوات الرئيسية اثنين من هذا التحليل هي تنقية البروتين والتصوير. في الخطوة الأولى، جميع البروتينات في الخلايا المسماة فلوريسسينتلي وبيوتينيلاتيد، ثم استخراج كل على حدة باستخدام هلام التفريد متبوعاً اليكترويلوشن. في الخطوة الثانية، يتم تقييم خصائص الأسفار من الجزيئات البروتينية الفردية في العينات المستخرجة استناداً إلى تصوير جزيء واحد. صبغ معالم هامة لتحليل عد الأصوات، مثل النسبة المئوية للبروتين المسمى مع واحد على أقل من هذه البيانات،، الذي نسميه التوسيم شغل (لو)16، ومتوسط عدد من الأصباغ الفلورية ملزمة لجزيء بروتين واحد (n̄ صبغ)، يمكن أن توصف. في البروتوكول، إجراء أمثل لوسم البروتين هيلا الخلية مع دائرة الصحة الوطنية المستندة إلى إستر صبغ Cyanine 3 (Cy3) يرد على سبيل مثال، ويمكن تعديلها مع الإجراءات الأخرى وضع العلامات وفقا للأهداف المرجوة من البحث.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لتحديد مقدار تجانس وضع العلامات لكل نوع من الأنواع المسماة البروتين في الخلايا بعد الانفصال مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3). يمكن أن يكون محل أسلوب الفصل مع أساليب أخرى مثل كروماتوغرافيا سائلة أو التفريد الشعرية، التي تسمح بفصل وتجزئة البروتينات ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون أونو تغلبت ونيشيمورا كازويا للمشورة والمساعدة التجريبية. تم دعم هذا العمل من المعزوفة (JPMJPR15F7)، واليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا، معونة للشباب العلماء (A) (24687022)، وتحدي البحوث الاستكشافية (26650055)، والبحوث العلمية في “المجالات المبتكرة” (23115005)، جمعية اليابان تعزيز العلوم، ومن المنح المقدمة من المؤسسة وتاكيدا للعلوم ومؤسسة النصب التذكاري موشيدا للبحوث الصيدلانية والطبية. س. ل. وتسلم الدعم المقدم من البرنامج بتبريد الدولي البرنامج المعاون (IPA).
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
