Количественная оценка гетерогенных распределение синаптических белков в мозг мыши, с помощью иммунофлюоресценции

Связь между нейронами происходит на специализированных сайтах контакта, называется синапсы. Синапсы содержат множество различных белков, которые оркестровать синаптической передачи. Некоторые из этих белков показывают гетерогенных распределение всей нервной системы и не присутствуют в каждом синапсе¹. Одним из примеров такого белок является Munc13, который участвует в процессе грунтования синаптических пузырьков. Существуют разные изоформы Munc13, которые распространяются гетерогенно во всем мозг², и наличие или отсутствие конкретных изоформ могут влиять на краткосрочные синаптической пластичности и синаптических пузырьков динамики^{3, 4 , 5}. Таким образом, он имеет жизненно важное значение, чтобы иметь возможность определить наличие различных синаптических белков различных областях мозга.

Методы выбора для квантификации синаптических белков – пока -, масс-спектрометрия и западной blotting, вместо иммуногистохимия^6,,78,9. В некоторых случаях несколько методов используются для дополнения друг друга, чтобы оценить количество и локализации специфических белков (то есть, Вильгельм и др. ¹⁰). метод, мы опишем здесь позволяет для локализации и количественной оценки протеинов интереса без необходимости использования любого биохимического метода, просто используя immunofluorescent stainings. Еще одним преимуществом здесь является количественная оценка может быть сделано над районами гораздо меньше, и, таким образом, более конкретные, чем достичь другими методами. Однако надо принимать во внимание, что белок надежные ссылки необходимы для оценки распределения протеина интереса.

Флуоресцентный окрашивание по иммуногистохимия позволяет нам регулярно выявить Локализация белков различных областях мозга, а также в рамках различных нейрональных отсеков. Для идентификации различных отсеках, используются конкретные маркеры. Как правило антитела против синапсины и synaptophysin¹¹ может использоваться для обозначения синаптических пузырьков, в то время как антитела против Фагот ярлык активную зону пресинаптической терминал¹². Везикулярный транспортер, например глютамат Везикулярный транспортер (vGluT) или Везикулярный транспортер ГАМК (vGAT), используются для обозначения возбуждающим¹³ и тормозящий¹⁴ Пресинаптический терминалы, соответственно. На стороне постсинаптических антитела против белков Гомер может использоваться для Марк постсинаптических терминалы и антител против постсинаптических плотность белка 95 (PSD95)^15,,1617 или gephyrin^{18 , 19 , 20} может маркировать возбуждающим или тормозной постсинаптический терминалы, соответственно. С помощью антител против протеина интереса и маркеры например, описанным выше, можно определить локализацию таких белков. Многие исследования на сегодняшний день это сделали в качественным образом²¹. Однако достоверно определить дифференцированного распределения конкретных синаптических белков, нужно не только определить свое присутствие или отсутствие, но также его относительной концентрации. Неоднородности размеров и плотности синапсы делает его важным установить соотношение между синаптических маркер и протеина интереса. В противном случае СИНАПС богатые регионы, как-пирамидальной слои гиппокампа и молекулярный слой мозжечка покажет высокой плотности синаптических белков, только благодаря более высокой плотности синапсов но не сильное присутствие этого белка в каждый синапс (например, Wallrafen и Dresbach-¹). С другой стороны белки в нейрональных Сома (например, TGN38²²) обычно покажет сильное присутствие в гиппокампе пирамидальной клетке слоя или слоя клеток гиппокампа или мозжечковая гранул из-за высокой концентрации нейрональных клеток органов в этих областях. Таким образом эта неоднородность распределения структур, в этом случае синапсов, может привести к ложной оценки распределения протеина интереса сам. Кроме того существует внутренняя изменчивость в пятнать интенсивностей различных образцов в stainings иммуногистохимии. Протокол, описанные здесь принимает это во внимание и избегает такого предубеждения, а также другие предостережения, которые возникают от иммуногистохимических методов.

В наши последние исследования, мы использовали этот метод для описания дифференциального выражение движителя (также называемый TPRGL²³ или²⁴SVAP30) через 16 различных мозга области¹. Мувер является позвоночных конкретных синаптических белок, который можно найти в ассоциации для синаптических пузырьков и влияет нейромедиатора релиз^25,,2627. Мы связаны Mover выражение обилие синаптических пузырьков, путем пятнать для synaptophysin как маркер ссылки синаптических пузырьков. Мы нашли высокие уровни движителя особенно в межпредсердной перегородки ядер и брюшной pallidum, миндалины. В гиппокампе мы нашли гетерогенных распределение Mover, с высоким уровнем в слои, связанные с внутри гиппокампа вычисления и низкий уровень в слои ввода и вывода.