Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Kommunikation zwischen den Nervenzellen geschieht an speziellen Kontaktstellen, die Synapsen genannt. Synapsen enthalten eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen, die synaptische Übertragung zu orchestrieren. Einige dieser Proteine zeigen eine heterogene Verteilung im gesamten Nervensystem und sind nicht in jeder Synapse-¹. Ein Beispiel für solche ein Protein ist Munc13, die Grundierung der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Es gibt verschiedene Isoformen von Munc13, die das Gehirn²heterogen verteilt sind, und das Vorhandensein oder Fehlen von bestimmten Isoformen beeinflussen kann kurzfristige synaptische Plastizität und synaptischen Vesikel Dynamik^{3, 4 , 5}. Daher ist es von entscheidender Bedeutung für das Vorhandensein von verschiedenen synaptischen Proteine in Hirnregionen identifizieren zu können.

Die Methoden der Wahl für die Quantifizierung der synaptischen Proteine – bis jetzt – sind Massenspektrometrie und Western Blot, anstatt Immunohistochemistry^6,7,8,9. In einigen Fällen sind verschiedene Methoden zur Bewertung der Menge und die Lokalisierung von bestimmten Proteinen (d.h., Wilhelm Et Al. ergänzen ¹⁰). die Methode wir hier beschreiben ermöglicht die Lokalisierung und Quantifizierung von Proteinen ohne die Notwendigkeit der Verwendung biochemische Methode, einfach nur immunofluorescent Färbungen. Ein weiterer Vorteil hier ist, dass die Quantifizierung, über Flächen, die viel kleiner möglich ist und daher genauer als die durch andere Methoden erreicht. Man muss jedoch berücksichtigen, dass eine verlässliche Referenz-Protein benötigt wird, um die Verteilung des Proteins des Interesses zu beurteilen.

Fluoreszierende Färbung von Immunohistochemistry ermöglicht es uns, die routinemäßig die Lokalisierung der Proteine über Hirnareale sowie in verschiedenen neuronalen Kompartimenten identifizieren. Um die verschiedenen Fächer zu identifizieren, werden spezifische Marker verwendet. Antikörper gegen Wirbeltiere und Synaptophysin¹¹ ist in der Regel lässt sich die synaptischen Vesikel zu kennzeichnen, während Antikörper gegen Fagott die aktive Zone einer präsynaptischen terminal¹²beschriften. Vesikuläre Transporter, z. B. die vesikuläre Glutamat-Transporter (vGluT) oder vesikuläre GABA-Transporter (vGAT), werden verwendet, um exzitatorischen¹³ und hemmenden¹⁴ präsynaptischen Klemmen bzw. beschriften. Auf der postsynaptischen Seite können Antikörper gegen das Protein Homer eingesetzt werden anlässlich der postsynaptischen Terminals und Antikörper gegen postsynaptischen Dichte Protein 95 (PSD95)^15,16,17 oder Gephyrin^{18 , 19 , 20} können erregenden oder hemmenden postsynaptischen Terminals bzw. beschriften. Mithilfe von Antikörpern gegen ein Protein des Interesses und Markierungen wie oben beschrieben, kann man feststellen, die Lokalisierung von solchen Protein. Viele Studien bisher haben dies in einer qualitativen Weise²¹durchgeführt. Jedoch muss um die differenzierte Verteilung der ein bestimmtes synaptischen Protein zuverlässig zu bestimmen, nicht nur seine Anwesenheit oder Abwesenheit, sondern auch die relative Konzentration festgestellt werden. Die Heterogenität der Größe und Dichte der Synapsen ist es wichtig, ein Verhältnis zwischen dem synaptischen Marker und das Protein des Interesses zu etablieren. Andernfalls werden Synapse-reiche Regionen wie die nicht-pyramidale Schichten des Hippocampus und der molekularen Schicht des Kleinhirns zeigen eine hohe Dichte an synaptischen Proteine, nur aufgrund der höheren Dichte der Synapsen aber nicht aufgrund einer starken Präsenz von diesem Protein in Jede Synapse (z.B. Wallrafen und Dresbach¹). Auf der anderen Seite zeigen Proteine in die neuronale Soma (z.B., TGN38²²) in der Regel starken Präsenz im Hippokampus pyramidale Zellschicht oder hippocampal oder zerebelläre Granulat Zellschicht aufgrund der hohen Konzentration von neuronalen Zellkörpern in diesen Bereichen. Daher diese nicht-homogene Verteilung der Strukturen, in diesem Fall Synapsen, kann auf eine falsche Einschätzung der Verteilung des Proteins des Interesses selbst führen. Darüber hinaus gibt es eine intrinsische Veränderlichkeit in der Färbung Intensitäten über Proben in immunhistochemischen Färbungen. Das hier beschriebene Protokoll berücksichtigt dies und vermeidet solche Vorurteile, wie auch andere Einschränkungen, die durch immunhistochemischen Methoden entstehen.

In unserer letzten studieren, haben wir diese Methode um zu beschreiben, die differentielle Expression der Mover (auch genannt TPRGL²³ SVAP30²⁴) über 16 verschiedene Gehirn Bereiche¹verwendet. Mover ist ein Wirbeltier-spezifischen synaptischen Protein, finden Sie im Verein zu synaptischen Vesikel und beeinflusst die Neurotransmitter-Freisetzung^25,26,27. Wir haben den Mover-Ausdruck auf die Fülle der synaptischen Vesikel verwandt, durch Färbung für Synaptophysin als synaptischen Vesikel Referenz Marker. Hohes Maß an Mover fanden wir vor allem in der septal Kerne, die ventrale Troponema und der Amygdala. Im Hippocampus fanden wir eine heterogene Verteilung der Mover, mit einem hohen in den Schichten Intra-hippocampal Berechnung und niedrigen Niveau in Eingang und Ausgang Schichten zugeordnet.