蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化
Summary
ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。
Abstract
有無または特定のシナプス蛋白質のレベル、重度なシナプス伝達に影響を与えます。蛋白質の機能を解明、に加えてまたその分布を決定することが重要です。ここでは、蛍光抗体法、共焦点顕微鏡、シナプス蛋白質 (TPRGL または SVAP30 とも呼ばれます) の発動機の分布を決定するためのコンピュータ ベース解析を用いたプロトコルについて述べる.我々 はシナプス小胞の豊かさに対する定量的方法で発動機の分布の決定によりシナプス小胞タンパク質シナプトフィジンの発動機の分布を比較します。特に、このメソッドは、異なる研究内または異なる抗体または顕微鏡を用いたタンパク質の分布の比較を許可する実装潜在的可能性があります。本手法は、絶対蛍光レベルではなく、比率を生成することによって蛍光染色の固有の変動を回避できます。また、述べるメソッドにより、さまざまなレベルでのタンパク質の分布を分析する研究者: 海馬のまたは感覚の異なるレイヤーなどの一つの脳領域で異なるサブ領域に脳を全脳スライスから野。Mover は、シナプス小胞に関連付けられている脊椎動物に固有のタンパク質です。この方法では、頭脳区域、扁桃体、中隔核、腹側フトゲツツガムシとまた海馬の異なる層などの単一の脳領域内で高レベルの分散不均一の発動機を紹介します。
Introduction
ニューロン間の通信は、シナプスと呼ばれる特殊な接触部位で発生します。シナプスには、無数組み合わせによって、シナプス伝達の異なった蛋白質にはが含まれています。それらの蛋白質のいくつかは神経系全体の不均質分布を示しシナプス1には存在しません。そのような蛋白質のための 1 つの例は Munc13 は、シナプス小胞のプライミング プロセスに関与しています。2脳全体に分散不均一、Munc13 の異なるアイソ フォームがあるし、特定のアイソ フォームの存在の有無に影響を与える短期シナプスとシナプス小胞ダイナミクス3,4,5します。 したがって、極めて重要な脳の領域間で異なるシナプス蛋白質の存在を識別することができるためです。
シナプス蛋白質の – 今のところ – 定量化のための選択の方法は、質量分析法とウエスタンブロットというよりも、免疫組織化学6,7,8,9。量と (すなわち、ヴィルヘルムら特定の蛋白質の局在化の両方を評価するためにお互いを補完するためにいくつかのケースでいくつかのメソッドを使用します。10). ここで述べる手法によりローカリゼーションと単に蛍光染色を用いて、生化学的方法を使用を必要とせず興味の蛋白質の定量。ここでもう一つの利点は小さい領域上の定量化を行うことができ、したがって、それらよりも、具体的、他の方法で達成します。ただし、信頼性の高いリファレンス タンパク質が興味の蛋白質の分布を評価するために必要なことを考慮する必要があります。
免疫組織化学的蛍光染色異なる神経細胞コンパートメント内にあるだけでなく、脳の領域にわたって日常的にタンパク質の局在を識別することができます。別のコンパートメントを識別するために特定のマーカーが使用されます。通常、synapsin、シナプトフィジン11に対する抗体はファゴット抗体ラベル シナプス前ターミナル12のアクティブ ゾーン間シナプス小胞のラベルに使用できます。小胞性の GABA トランスポーター vgat (ノックアウト)、小胞グルタミン酸トランスポーター (vGluT) などの小胞輸送は、それぞれ興奮13と14抑制シナプス前ターミナルをラベルに使用されます。シナプス後側、シナプス ターミナルとシナプス後密度タンパク質 95 (PSD95)15,16,17または gephyrin18に対する抗体をマークするホーマー タンパク質に対する抗体を用いることができます。,19,興奮性、抑制性シナプス ターミナルにそれぞれラベル20を使用できます。関心と上述のものなどのマーカー蛋白質に対する抗体を使用して、このようなタンパク質の局在を決定できます。これまで多くの研究は、質的方法21でこれを行っています。ただし、特定のシナプス蛋白質の特異的分布を確実に判断するには、いずれかの必要がありますのみ決定その存在または不在だけでなく、その相対濃度。サイズの不均一性と密度シナプスのシナプス マーカーと興味の蛋白質の比率を確立することが重要になります。海馬の非錐体層、小脳分子層などのシナプスの豊富な地域がシナプス蛋白質、その蛋白の強い存在のためにないが、シナプスの密度が高いためだけの高密度が表示されますそれ以外の場合、それぞれのシナプスは (例えば、Wallrafen および Dresbach の1)。(例えば、TGN3822) 神経細胞体でタンパク質、海馬錐体細胞層や神経細胞の細胞体の高濃度のため海馬や小脳顆粒細胞層で強力なプレゼンスを通常表示する一方、それらの領域。したがって、構造、この非均一に分布はこの場合、シナプス、自体興味の蛋白質の分布の偽の推定につながることができます。さらに、免疫組織化学的染色のサンプル間で強度を染色に本質的な可変性があります。ここで説明されているプロトコルはこれを考慮し、免疫組織化学的方法から生じるその他の注意事項と同様に、そのようなバイアスを回避できます。
私たちの最近の研究は、我々 は 16 異なる脳領域1にわたって Mover (TPRGL23または SVAP3024とも呼ばれます) の差分式を記述するこのメソッドを使用しています。発動機は脊椎動物に固有のシナプス蛋白質シナプス小胞との関連で見つけることができますし、神経伝達物質のリリース25,26,27に影響を与えます。シナプス小胞の豊かさに発動機式シナプス小胞参照マーカーとしてシナプトフィジンの染色関連ている。特に中隔核, 腹側フトゲツツガムシと扁桃体に発動機の高レベルを見つけた。海馬はわかった海馬内計算と入力と出力層の低レベルに関連付けられているレイヤーのレベルが高い、Mover の不均質分布
Protocol
Representative Results
Discussion
メソッドは、既知の分布とマーカー蛋白質の豊かさに対する興味の蛋白質の分布の定量化を目指すを紹介しました。免疫蛍光染色染色強度の異なるスライスの間の高い可変性を示すことができます。ここで説明した定量化手法半球間なかに興味の蛋白質の比率を決定することによってこの問題を回避できます。したがって、スライス全体染色強度の違いキャンセルされ、定量的な説明を可能?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは優れたテクニカル サポート サポート ヴァイスシュヴァルツを感謝します。著者は、エルメスの Pofantis と Andoniya Petkova によるサポートを認めます。著者は、LSM800 と技術援助、特に博士ニルス Halbsgut の使用のための欧州の神経科学研究所もありがとうございました。この仕事は大学医療センター ゲッティンゲンで賄われていた。JSV は、顕微鏡によるナノスケールの分子生理学の脳 (CNMPB) センターでサポートを認めています。
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. . Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
