Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Communicatie tussen de neuronen gebeurt op gespecialiseerde contact sites synapsen genaamd. Synapsen bevatten een groot aantal verschillende eiwitten die orkestreren van synaptische transmissie. Sommige van deze eiwitten Toon een heterogene distributie in het zenuwstelsel en zijn niet aanwezig in elke synapse¹. Een voorbeeld van een dergelijke eiwitten is Munc13, die bij het proces van de priming van synaptische vesikels betrokken is. Er zijn verschillende isoforms van Munc13, die zijn ongelijkmatig verdeeld in de hersenen², en de aanwezigheid of de afwezigheid van specifieke isoforms kunt beïnvloeden op korte termijn synaptische plasticiteit en synaptische vesikel dynamics^{3, 4 , 5}. Daarom is het van vitaal belang voor zitten kundig voor de aanwezigheid van verschillende synaptic eiwitten over hersengebieden identificeren.

De methoden van keuze voor kwantificering van synaptic eiwitten – tot dusver – zijn massaspectrometrie en westelijke bevlekken, in plaats van immunohistochemistry^6,,^7,,^8,9. In sommige gevallen zijn verschillende methoden gebruikt als aanvulling op elkaar om te beoordelen van zowel het aantal en de lokalisatie van specifieke proteïnen (d.w.z.Wilhelm, et al.. ¹⁰). de methode we hier beschrijven voorziet de lokalisatie en de kwantificering van proteïnen van belang zonder de noodzaak van het gebruik van elke biochemische methode, gewoon dienst immunefluorescentie technieken. Een ander voordeel hier is dat de kwantificering kan worden gedaan over gebieden veel kleiner, verwezenlijkt en derhalve, meer specifiek, dan die door andere methoden. Echter moet men rekening houden dat een betrouwbare referentie-eiwit nodig is om te beoordelen van de verdeling van de proteïne van belang.

Fluorescerende vlekken door immunohistochemistry stelt ons in staat om routinematig de lokalisatie van eiwitten over hersengebieden alsook binnen verschillende neuronale compartimenten. Ter identificatie van de verschillende compartimenten, worden specifieke markers gebruikt. Typisch, antilichamen tegen synapsin en synaptophysin¹¹ kunnen worden gebruikt om te etiketteren van synaptische vesikels, terwijl antilichamen tegen fagot label de actieve zone van een presynaptische terminal¹². Vesiculaire vervoerders, zoals de vesiculaire glutamaat vervoerders (vGluT) of vesiculaire GABA vervoerder (vGAT), worden gebruikt voor het label excitatory¹³ en remmende¹⁴ presynaptische terminals, respectievelijk. Aan de postsynaptisch kant, kunnen antistoffen tegen het eiwit Homer worden gebruikt om te markeren postsynaptisch terminals en antilichamen tegen postsynaptisch dichtheid eiwit 95 (PSD95)^15,16,17 of gephyrin^{18 , 19 , 20} kan respectievelijk excitatory of remmende postsynaptisch terminals, label. Met behulp van antilichamen tegen een proteïne van belang en markeringen zoals degene hierboven beschreven, kan men de lokalisatie van dergelijke eiwitten bepalen. Veel studies tot nu toe hebben gedaan in een kwalitatieve wijze²¹. Echter om te bepalen op een betrouwbare manier de differentiële verdeling van een specifieke synaptic proteïne, moet een niet alleen bepalen de aanwezigheid of afwezigheid maar ook haar relatieve concentratie. De heterogeniteit van grootte en bevolkingsdichtheid van synapsen is het belangrijk om een verhouding tussen de synaptische markering en de proteïne van belang. Anders, synapse-rijke regio’s zoals de niet-piramidale lagen van de hippocampus en de moleculaire laag van het cerebellum zal tonen een hoge dichtheid van synaptic eiwitten, alleen als gevolg van de hogere dichtheid van synapsen maar niet als gevolg van een sterke aanwezigheid van deze eiwitten in elke synapse (b.v., Wallrafen en Dresbach¹). Aan de andere kant, zal eiwitten in de neuronale soma (b.v., TGN38²²) meestal sterke aanwezigheid in de hippocampal piramidale cellaag of hippocampal of cerebellaire submodule cellaag vanwege de hoge concentratie van neuronale cel organen weergeven in die gebieden. Deze niet-homogene verdeling van structuren, synapses daarom in dit geval, kan leiden tot een valse raming van de verdeling van de proteïne van belang zelf. Bovendien is er een intrinsieke variabiliteit in intensiteiten in verschillende steekproeven in technieken immunohistochemische kleuring. Het protocol beschreven hier houdt dit rekening en vermijdt dergelijke vooroordelen, evenals andere beperkingen die voortvloeien uit de immunohistochemische methoden.

In onze recente studie, wij hebben gebruikte deze methode voor het beschrijven van de differentiële expressie van Mover (ook wel TPRGL²³ SVAP30²⁴) over 16 verschillende hersenen gebieden¹. Verhuizer is een gewerveld dier-specifieke synaptic eiwit dat kan worden gevonden in associatie met synaptische vesikels en invloeden van de neurotransmitter release^25,26,27. We hebben de Mover uitdrukking aan de overvloed van synaptische vesikels, gerelateerde door kleuring voor synaptophysin als merkstof referentie synaptic blaasje. We vonden de hoge niveaus van de Verhuizer van met name in de septal kernen, de ventrale pallidum en de amygdala. Binnen de hippocampus vonden we een heterogene verdeling van de Mover, met hoge niveaus in de lagen die zijn gekoppeld aan de intra-hippocampal berekening, en lage niveaus in de input- en output lagen.