माउस मस्तिष्क में एक Synaptic प्रोटीन के विषम वितरण बढ़ाता इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग
Summary
यहां, हम एक synaptic एक मार्कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग प्रोटीन के सापेक्ष प्रोटीन के वितरण का निर्धारण करने के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण का वर्णन, फोकल माइक्रोस्कोपी, और कंप्यूटर आधारित विश्लेषण ।
Abstract
उपस्थिति, अनुपस्थिति, या विशिष्ट synaptic प्रोटीन का स्तर गंभीर रूप से synaptic संचरण को प्रभावित कर सकते हैं । एक प्रोटीन के समारोह elucidating के अलावा, यह भी इसके वितरण का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस काम प्रोटोकॉल का वर्णन, फोकल माइक्रोस्कोपी, और कंप्यूटर आधारित विश्लेषण synaptic प्रोटीन प्रस्तावक के वितरण का निर्धारण (TPRGL या SVAP30 भी कहा जाता है) । हम synaptic पुटिका प्रोटीन synaptophysin की है कि प्रस्तावक के वितरण की तुलना, जिससे एक मात्रात्मक तरीके synaptic बुलबुले की बहुतायत के सापेक्ष में प्रस्तावना के वितरण का निर्धारण । विशेष रूप से, इस विधि संभवतः विभिंन एंटीबॉडी या सूक्ष्मदर्शी या विभिंन अध्ययनों के पार का उपयोग कर प्रोटीन के वितरण की तुलना के लिए अनुमति देने के लिए लागू किया जा सकता है । हमारी विधि immunofluorescent दाग के अंतर्निहित परिवर्तनशीलता एक अनुपात के बजाय निरपेक्ष प्रतिदीप्ति स्तर उपज से दरकिनार । इसके अतिरिक्त, हम वर्णन विधि शोधकर्ता को विभिंन स्तरों पर एक प्रोटीन के वितरण का विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है: पूरे मस्तिष्क स्लाइस से मस्तिष्क क्षेत्रों में एक मस्तिष्क क्षेत्र में विभिंन उपक्षेत्रों के लिए, हिप्पोकैम्पस या संवेदी के विभिंन परतों के रूप में cortices । प्रस्तावक एक हड्डीवाला-विशिष्ट प्रोटीन है कि synaptic बुलबुले के साथ जुड़ा हुआ है । इस विधि के साथ, हम बताते है कि प्रस्तावक विषम मस्तिष्क क्षेत्रों में वितरित की है, ventral pallidum, septal नाभिक, और प्रमस्तिष्कखंड में उच्च स्तर के साथ, और भी एक मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर, जैसे हिप्पोकैम्पस के विभिंन परतों के रूप में ।
Introduction
न्यूरॉन्स के बीच संचार synapses नामक विशेष संपर्क साइटों पर होता है. Synapses विभिंन प्रोटीन है कि synaptic संचरण आर्केस्ट्रा के असंख्य होते हैं । उन प्रोटीन से कुछ तंत्रिका तंत्र भर में एक विषम वितरण दिखाने के लिए और हर synapse1में मौजूद नहीं हैं । ऐसे प्रोटीन के लिए एक उदाहरण Munc13 है, जो synaptic बुलबुले की भड़काने की प्रक्रिया में शामिल है । वहां Munc13 के विभिंन isoforms, जो विषम मस्तिष्क2भर में वितरित कर रहे हैं, और उपस्थिति या विशिष्ट isoforms की अनुपस्थिति अल्पकालिक synaptic प्लास्टिक और synaptic पुटिका गतिशीलता 3 को प्रभावित कर सकते हैं, 4 , 5. इसलिए, यह महत्वपूर्ण महत्व का है करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों में विभिंन synaptic प्रोटीन की उपस्थिति की पहचान कर सकता है ।
synaptic प्रोटीन के ठहराव के लिए पसंद के तरीके-अब तक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और पश्चिमी सोख्ता, immunohistochemistry6,7,8,9के बजाय कर रहे हैं । कुछ मामलों में, दोनों मात्रा और विशिष्ट प्रोटीन (यानी, विल्हेम एट अल के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए एक दूसरे के पूरक करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जाता है । 10). विधि हम यहां का वर्णन स्थानीयकरण और किसी भी जैव रासायनिक विधि का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना ब्याज की प्रोटीन की ठहराव के लिए अनुमति देता है, बस immunofluorescent दाग को रोजगार । यहां एक और लाभ यह है कि ठहराव बहुत छोटे क्षेत्रों पर किया जा सकता है और, इसलिए, अधिक विशिष्ट, अंय तरीकों से हासिल की तुलना में उन । हालांकि, एक को ध्यान में रखना है कि एक विश्वसनीय संदर्भ प्रोटीन के लिए ब्याज की प्रोटीन के वितरण का आकलन करने की जरूरत है ।
immunohistochemistry की वजह से हम नियमित रूप से मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रोटीन के स्थानीयकरण की पहचान करने की अनुमति देता है और साथ ही विभिन्न न्यूरॉन डिब्बों के भीतर. विभिन्न डिब्बों की पहचान करने के लिए, विशिष्ट मार्कर का उपयोग किया जाता है । आमतौर पर, synapsin और synaptophysin11 के खिलाफ एंटीबॉडी synaptic बुलबुले लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि एंटीबॉडी के खिलाफ एक presynaptic टर्मिनल12के सक्रिय क्षेत्र लेबल । Vesicular ट्रांसपोर्टरों, जैसे Vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर (vGluT) या Vesicular गाबा ट्रांसपोर्टर (vGAT), क्रमशः उत्तेजक13 और निरोधात्मक14 presynaptic टर्मिनलों लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है । postsynaptic ओर, होमर प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी postsynaptic टर्मिनलों को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, और postsynaptic घनत्व प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी ९५ (PSD95)15,16,17 या gephyrin18 , 19 , 20 उत्तेजक या निरोधात्मक postsynaptic टर्मिनलों, क्रमशः लेबल कर सकते हैं । ब्याज और मार्करों जैसे लोगों के ऊपर वर्णित के रूप में एक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके, एक ऐसे प्रोटीन के स्थानीयकरण निर्धारित कर सकते हैं । तिथि करने के लिए कई अध्ययनों से यह एक गुणात्मक तरीके से21में किया है । हालांकि, मज़बूती से एक विशिष्ट synaptic प्रोटीन की विभेदक वितरण निर्धारित करने के लिए, एक ही अपनी उपस्थिति या अनुपस्थिति लेकिन यह भी अपने रिश्तेदार एकाग्रता का निर्धारण नहीं करना चाहिए । आकार और synapses के घनत्व के विविधता यह synaptic मार्कर और ब्याज की प्रोटीन के बीच एक अनुपात स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण बनाता है । अंयथा, synapse-हिप्पोकैम्पस की गैर-पिरामिडीय परतों और सेरिबैलम के आणविक परत जैसे समृद्ध क्षेत्रों synaptic प्रोटीन का एक उच्च घनत्व दिखाएगा, केवल synapses के उच्च घनत्व के कारण नहीं बल्कि उस प्रोटीन की एक मजबूत उपस्थिति के कारण प्रत्येक synapse (उदा., Wallrafen आणि Dresbach१). दूसरी ओर, न्यूरॉनी सोमा (जैसे, TGN3822) में प्रोटीन आमतौर पर हिप्पोकैम्पस हवामहल सेल परत या हिप्पोकैम्पस या अनुमस्तिष्क granules कोशिका परत में मजबूत उपस्थिति दिखाने के लिए होगा कारण न्यूरॉन सेल निकायों की उच्च एकाग्रता के लिए उन क्षेत्रों में । इसलिए, संरचनाओं के इस गैर सजातीय वितरण, इस मामले synapses में, ब्याज खुद के प्रोटीन के वितरण का एक झूठा आकलन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, वहां एक आंतरिक परिवर्तनशीलता में immunohistochemical दाग में नमूनों के पार तीव्रता धुंधला है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित विचार में यह लेता है और ऐसे पूर्वाग्रहों से बचा जाता है, साथ ही अंय निरंतर कि immunohistochemical तरीकों से उठता है ।
हमारे हाल के अध्ययन में, हम इस विधि का इस्तेमाल किया है मूवर्स के अंतर अभिव्यक्ति का वर्णन (भी23 TPRGL या SVAP3024बुलाया) 16 विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों में1। मूवर्स एक हड्डीवाला-विशिष्ट synaptic प्रोटीन है कि synaptic बुलबुले के संबंध में पाया जा सकता है और प्रभाव न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज25,26,27. हम एक synaptic पुटिका संदर्भ मार्कर के रूप में synaptophysin के लिए दाग द्वारा synaptic बुलबुले की बहुतायत करने के लिए प्रस्तावना अभिव्यक्ति से संबंधित है । हम septal नाभिक, ventral pallidum, और प्रमस्तिष्कखंड में विशेष रूप से प्रस्तावक के उच्च स्तर पाया । हिप्पोकैम्पस के भीतर, हम मूवर्स के एक विषम वितरण, अंतर हिप्पोकैम्पस अभिकलन के साथ जुड़े परतों में उच्च स्तर के साथ पाया गया, और इनपुट में निंन स्तर और उत्पादन परतों ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत विधि एक ज्ञात वितरण के साथ एक मार्कर प्रोटीन की बहुतायत के सापेक्ष ब्याज की एक प्रोटीन के वितरण को बढ़ाता है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला अलग स्लाइस के बीच धुंधला तीव्रता की एक उच्च परिवर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Irmgard Weiss धंयवाद । लेखक हेमीज़ Pofantis और Andoniya Petkova द्वारा समर्थन स्वीकार करते हैं । लेखक भी LSM800 और तकनीकी सहायता के उपयोग के लिए यूरोपीय तंत्रिका विज्ञान संस्थान, विशेष रूप से डॉ निल्स Halbsgut द्वारा धंयवाद । इस काम को यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर गौटिंगेन ने वित्तपोषित किया था. जेएसवी मस्तिष्क (CNMPB) के नेनो माइक्रोस्कोपी और आणविक फिजियोलॉजी के लिए केंद्र द्वारा समर्थन स्वीकार करता है ।
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
References
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