在该协议中, 我们描述了快速分离细胞外泡从人类全血和特定标记的完整的工作流程, 通过荧光为基础的纳米粒子跟踪分析。结果表明, 该方法具有较高的重现性, 可根据细胞培养上清液的需要进行调整。
细胞外囊泡 (ev), 包括外显子体, 是在体液中发现的特殊膜质纳米囊泡, 这些囊泡从许多细胞类型中形成了本组织释放, 在调节细胞通讯和各种细胞通信方面发挥着关键作用。生物过程。描述了许多不同的电动车特性方法。然而, 这些方法大多有缺点, 即样品的制备和表征非常耗时, 或者由于其体积小和缺乏离散标记, 很难分析感兴趣的特定标记。人口。虽然在过去十年中, 电动车的分析方法有了很大的改进, 但仍然没有标准化的单一电动车定性方法.在这里, 我们展示了一种基于荧光的纳米粒子跟踪分析对单个 ev 进行表征的半自动方法。该协议解决了这一领域许多研究人员的共同问题, 并提供了完整的工作流程, 以便使用 pkh67 (一般细胞膜链接器 pkh67) 以及特定的表面标记 (如作为 cd63、cd9、vimentin 和溶酶相关膜蛋白 1 (lamp-1)。所提供的结果表明, 正如西方印迹等其他方法所证实的那样, 具有较高的重现性。在所进行的实验中, 我们专门使用从人体血清样本中分离出的 ev, 但这种方法也适用于血浆或其他体液, 可以根据细胞培养上清液中的 ev 的特性进行调整。无论未来电动汽车生物学的研究进展如何, 本文提出的协议都为具有特定标记的单个 ev 的快速表征提供了一种快速可靠的方法。
细胞外囊泡 (ev), 包括外显子体, 是专门的膜质纳米囊泡 (20-150 nm), 包含脂质、粘附和细胞间信号分子的某些组合, 以及其他功能性胞增多成分, 如微 rna (mirna) 和 mrna, 在调节细胞通讯1,2中起着举足轻重的作用。ev 在其环境中从许多不同的细胞类型 (如内皮细胞、免疫细胞和肿瘤细胞) 中释放, 并可在体液中检测到, 如血清精液、尿液、母乳、唾液或脑脊液3,4. 越来越多的研究突出表明, 电动车作为早期诊断几种疾病和预测疾病进展的潜在生物标志物的各种贡献。外质体通常是由它们与之有特殊联系的分子的存在来描述的, 无论它们从7 中获得的细胞类型是什么。例如, 外显子含有不同的四帕那因 (cd9, cd63, cd81), 主要组织相容性复合体 i 类 (mhc i) 分子, 各种跨膜蛋白, 典型的细胞质蛋白 (管蛋白和肌动蛋白), 参与多囊体的分子 (cd9, cd63, cd81)mvb) 生物发生 (tsg101 和 alix)、热休克蛋白 (hsp 70 和 hsp 90) 以及参与信号转导 (蛋白激酶)的蛋白质8。
描述了许多不同的方法来描述 ev9。电动汽车分析最常见和最普遍的方法是流式细胞术10、扫描电子显微镜 (sem) 和透射电子显微镜 (tem)11。最好的方法是对 ev 含量进行生化表征, 最常用的方法是西方印迹12,13。虽然 sem 和 tem 允许检测整个尺寸谱中的 ev, 但对特定表面蛋白质的识别非常有限是这些方法的一个特别缺点。相反, 流式细胞术是识别特定 ev 表面标记的有力工具, 但这种方法的阈值将分析限制为尺寸大于500纳米的 ev。因此, 目前无法通过这三种既定的方法中的任何一种来分析孤立的电动车, 并检测到特定的表面标记。我们之前描述了另一种高度敏感的方法, 可视化和分析的 ev, 纳米粒子跟踪分析 (nta)14。简单地说, 这种方法结合了两种不同的物理原理。首先, 粒子在被激光束照射时散射光, 第二个原理被称为布朗运动, 这意味着液体悬浮液中不同粒子的扩散与其大小成反比。用于液体样品的半自动桌面纳米粒子分析仪由基于软件的分析的粒子跟踪分析仪组成, 记录了单个颗粒散射光的数字图像。用摄像机的激光散射显微镜检测粒子和粒子的运动。激光束是垂直方向的, 而光轴是水平的, 并聚焦到充满样品的电池通道。通过分散光点图及其运动速度提供的数据, 可以确定总颗粒数量和粒径分布。在激光照射后, 粒子散射光线, 由数字摄像机通过显微镜14记录. 我们以前的方法的进展是在激光 (波长 488 nm) 和细胞通道之间插入一个500纳米长的波通 (lwp) 截止滤波器, 从而能够直接分析荧光标记的粒子 (图 1)。我们的协议解决了许多研究人员在这一领域的共同需求, 即根据其父母出身,快速描述单个电动车。在该协议中, 我们描述了快速隔离 ev 与人体全血的完整工作流程, 以及利用基于荧光的纳米跟踪分析快速表征特定标记物的工作流程。ev 可以通过使用 pkh67 (一种普通的细胞膜链接器) 染色以及特定的外染色体标记 (如cd63、cd9 和 vimentin) 进行检测。我们的协议也适用于 edta 和柠檬酸血浆, 以及其他体液和细胞培养上清液。
我们展示了一个详细的方案, 从全血分离 ev 和快速表征特定的表面标记与荧光纳米粒子跟踪分析。在所进行的实验中, 我们专门使用从血清样本中分离出的 ev, 但这种方法也适用于乙二胺四乙酸 (edta) 和柠檬酸血浆, 也可以扩展到其他体液, 如尿液, 母乳, 唾液,脑脊液和精液此外, 该协议还可以根据细胞培养上清液中的 ev 特性进行调整。在该协议中, ev 悬浮液是由100μl 的血清使用外源沉淀试剂产生的, 该试剂中含有一种专有聚合物, 根据从30纳米到200纳米的体积大小, 即 10-20μl, 轻轻沉淀外质和 ev为每个表面标记的特征指定了 ev。不幸的是, 隔离步骤是不可避免的, 因为血清样本中的大量蛋白质 (如白蛋白和球蛋白) 会干扰抗体染色程序, 并导致高水平的背景和复杂的发现。此外, 根据样品中外显体的生物可用性, 使用的 ev 悬浮液的数量以及加工前的稀释程度必须针对其他源材料进行调整。为了比较多个样品, 有必要采用标准化的方法来稀释样品以及一致的采集参数 (灵敏度、快门等)。另一个重要的一点是, 测量不会开始, 直到漂移低 (在我们手中, < 5μms)。如果漂移过高, 重复测量样品之间会产生较高的标准偏差, 但在漂移较低的情况下, 所产生的数据高度一致, 并确认了较高的重现性。重要的是, 所选择的抗体有一个适当的氟铬。抗体必须与亚历克莎福陆488结合, 因为 fitc 的光漂白率很高。更稳定的河流肯定会导致未来检测稳定性的提高。通常情况下, 许多研究人员使用 pbs 作为电动汽车的稀释剂.对于这个协议, 使用蒸馏水作为电动车悬架的稀释剂是至关重要的。当 ev 标记为荧光染料时, 其他稀释剂 (如 pbs) 的高渗透性和离子浓度会干扰测量, 并导致结果改变。
虽然在过去十年中, 电动车的分析方法有了很大的改进, 但仍然没有标准化的电动车隔离和表征方法.流式细胞术的主要缺点是, 许多 ev 停靠在表面上, 以提供强大且可检测到的信号10, 其中 ev 通常与珠子结合在一起, 以提供更大的表面。sem 和 tem 的缺点是样品的制备很耗时, ev 只能通过其大小和形态来区分。到目前为止, 最成熟和最常用的定性 (即生化) ev 特性的方法是西方印迹, 其中蛋白质可以用特定抗体12,13进行分析。然而, 所有这些方法的缺点在于无法分析特定表面标记的单个 ev。此外, 许多现行协议使用的处理时间长, 隔离过程长, 涉及劳动密集型步骤, 因此不适合高样品吞吐量和单个 ev 的表征.我们的协议提供了一个完整的工作流程, 用于快速隔离和表征具有特定表面标记 (如 cd63、cd9、vimentin 和 cd107a) 的单个 ev, 并可扩展到广泛的其他表面标记, 以确定发布的 evs.由于 nta 设备的长期技术进步, 我们与制造商合作, 使用最新的分析仪确认了我们的发现。无论未来电动汽车生物学的研究进展如何, 特别是外显子的研究进展如何, 这里介绍的协议都将为用特定标记对单个 ev 进行定性提供一种快速可靠的方法。由于在隔离和染色过程中的 ev 聚合是不可避免的, 因此未来的研究应侧重于开发防止 ev 聚合的方法, 并能够准确地确定荧光标记 ev 的尺寸.
The authors have nothing to disclose.
作者感谢粒子 metrix gmbh 部分地支付了这项工作的出版费用。
Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |