나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

뒤셀도르프 대학 기관 윤리 위원회는이 작품에서 제시 하는 실험을 승인 했습니다 (참조 번호: 3381). 1. EV 격리 인간의 전체 혈액에서 Exosome 강수량 솔루션 EVs를 격리 합니다. 혈 청 분리 관 (SST) 통해 venipuncture에 인간의 전체 혈액의 2 개 mL를 수집 하 고 응고가 완료 될 때까지 실 온 (RT)에서 15 분 동안 튜브를 품 어. 1700 x g 혈 청에서 세포를 분리 하 고 1.5 mL 반응 관에 혈 청 1 mL를 전송 하는 RT에 10 분에서 SST 원심 혈소판을 제거 하 고 새로운 1.5 mL 반응 관에 혈소판 가난한 플라스마 (PPP)의 100 μ 전송 하 4 ° C에서 15 분 동안 3000 x g 에서 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)을 원심. 철저 하 게 exosome 강수량 솔루션 (4 개 부품 PPP, 1 부분 exosome 강수량 솔루션) 및 소용돌이의 25 µ L를 추가 합니다. 얼음에 30 분에 대 한 샘플을 품 어. 튜브를 똑바로 유지 하 고 회전 하거나 마십시오 인큐베이션 기간 동안 튜브를 혼합. EVs를 펠 렛을 4 ° C에서 30 분 동안 1500 x g 에서 샘플 원심 원심, 후 EVs 그릇의 하단에 베이지색 이나 흰색 펠 릿으로 나타납니다. 상쾌한 발음 및 4 ° c.에서 5 분 동안 1500 x g 에서 샘플을 원심 액체의 모든 흔적을 제거 하 고 다시 자주 아래로 pipetting으로 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 100 µ L에 펠 릿을 일시 중단. 분석은 즉시 수행 되지 때-80 ° C에서 EV 정지를 저장 합니다.참고: 때 플라즈마에서 EVs를 격리, fibrinogen 및 섬유 소 수 방해 효율적인 복구 물의 resuspension 무거운 하 고 더 많은 시간이 걸립니다. Ultracentrifugation와 EVs를 격리 합니다. 받아 냉장고를 사용 하기 전에 ultracentrifuge 다운 멋진 사전 냉각된 회전자 (TLA 55 고정-각도). 1.25 mL (단계 1.1에서에서 준비) PPP의 모자와 적당 한 1.5 mL ultracentrifugation 튜브 전송과 110000 x g 4 ° c.에 90 분에서 샘플을 원심 시작 하기 전에 터 부하 균형은 다는 것을 확인 하십시오. 상쾌한 가만히 따르다와 장소 튜브-거꾸로 2 분에 대 한 종이 타월에 다시 PBS의 500 μ에 펠 릿을 일시 중단 하 고 원심 110000 x g 4 ° c.에 90 분에서 샘플 발음은 상쾌한 고 다시 PBS의 50 μ에 펠 릿을 중단.참고: 사용로 터와 사용 중인 ultracentrifuge를 위한 액세서리. 튜브의 강도 많은 사이 다 수 있기 때문에 물을 사용 하 여 회전자에 튜브를 미리 테스트. 2. 샘플의 얼룩 PKH67와 얼룩. 철저 하 게 1.5 mL 반응 관에 믹스 PKH67 ethanolic 염료 해결책의 1 μ 희석제 C (키트에 포함)의 50 μ에 추가 하 여 얼룩 솔루션을 준비 합니다. 반응 관에 EV 정지 (단계 1.1에서에서 준비) 20 μ 얼룩 솔루션의 10 μ 전송, 철저 하 게 혼합 하 고 어둠 속에서 RT에 5 분 동안 품 어. 15 mL 반응 관에 2.5 mL 증 류 물으로 얼룩진된 EV 현 탁 액의 희석 50 μ, 철저 하 게 혼합 하 고이 마지막 정지를 사용 하 여 입자 측정을 위한.참고:이 희석제로 물을 사용 하 여 EV 정지에 대 한 중요 한 다른 diluents (예를 들어, PBS) 측정을 손상 시킬 수 있기 때문에. EV-서 스 펜 션, 저장 사용 하 여 얼음 샘플을 녹여 고 얼룩이 지기 전에 철저 하 게 혼합. 특정 항 체와 얼룩. 희석 증류수 1.5 mL 반응 관에 혼합의 50 μ로 (단계 1.1에서에서 준비) EV 정지의 10-20 μ 철저 하 게. 반응 관에 특정 항 체 (표 1)의 2.5-5 μ를 추가 하 고 혼합 철저 하 게, 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어. 2.5-10 ml 증류수 (표 1) 15 mL 반응 관에 얼룩진된 EV 서 스 펜 션의 50 μ를 전송 하 고, 철저 하 게 혼합 입자 측정이 최종 서 스 펜 션 사용 합니다.참고: 일부 상황에서 사용 된 항 체의 농도 이어야 합니다 (표 1)을 조정. 3. 샘플의 처리 참고:이 방법의 기본 광범위 하 게 설명 했다 이전 및 프로토콜 초점 아래 형광 표시 된 EVs14의 분석에 필요한 특정 단계에. 시작 절차를 수행 합니다. 현미경과 카메라의 광 경로에 형광 필터를 밀어. 프로그램을 시작 하 고 자동화 된 구현에 대 한 화면 지침을 따르십시오. 형광 측정 “셀 확인” 탭 (셀 정의)에서 정확한 휴대폰 번호 (Z158_C1149_Fluor)를 선택 합니다. 광학 현미경과 레이저는 일반적인 초점 (레이저 현미경이 위치로 자동으로 이동)에 다는 것을 확인에 대 한 참조 위치를 선택 합니다. 주사기의 증류수 10 mL로 가득 셀 채널을 플러시. 측정 셀 공기 방울의 무료 인지 확인 하 고 시스템에 공기 방울을 주입 하지 마십시오. 유니폼 200 nm 크기의 형광 표시 폴리스 티 렌 입자 카복실산 그룹 그들의 표면에 있는 포함 하는 교정 정지를 준비 합니다. 990 μ와 희석 10 μ 입자의 증류수. 다음에 필요한 농도를 증류수 10 mL와 10 μ 15 mL 튜브에이 입자 솔루션의 희석. 셀 채널에서 희석된 입자 솔루션의 2.5 mL를 주사 하 고 “초점 최적화”를 클릭 카메라를 조정. 샘플을 측정 합니다. 각 샘플 측정 전에 증류수 10 mL로 채워진 주사기 셀 채널 여러 번을 플러시. 셀으로 얼룩진된 EV 현 탁 액 (2 단계에서 준비)를 주사. 필요 (표 2)로 소프트웨어의 “셀” 확인 탭에서 다음과 같은 주요 카메라 매개 변수를 조정 합니다. 기준 위치를 사용 하거나 매개 변수를 조정 하는 0.41193 위치. 감도, “수 입자 대 감도” 버튼을 클릭 하 여 최적의 감도 범위 찾을 다른 감도 레벨 화면 당 측정 된 입자의 곡선을 표시 하려면.참고: 셔터, 카메라 결정된 간격을 통과 하는 빛을 허용 하는 기간을 조정 합니다. 20, 20의 최소 크기의 최소 밝기 선택 후 인수 매개 변수에 대 한 nm, 그리고 500의 최대 크기 측정에 대 한 nm. 참고 검색 된 입자의 수는 디스플레이에서 시야에 계산. 산란 바 녹색 주황색 범위 (50-300 입자)을 해야 합니다. 산란 바 빨간색 이면 살포는 개별 입자 융합 것입니다 그리고 그들은 1 개의 단 하나 입자, false 결과 하로 계산 됩니다. 이러한 경우, 추가 입자의 중복을 피하기 위해 샘플을 희석 하거나 낮은 감도. 측정을 시작 하기 전에 “확인 입자 드리프트 0 V에서” “셀 검사” 탭에서 클릭 하십시오. 드리프트 5 μ m/s 보다 높은 경우는 샘플 측정을 계속 흐르는 중지 될 때까지 기다립니다.참고: 드리프트 측정의 시작 부분에서 너무 높은 경우에, 반복된 측정 수 있습니다 다 고 결과 세상일. 주권의 기본 원리 때문 관련 드리프트는 소프트웨어에 의해 계산 된 결정된 입자 크기에 영향을 있을 수 있습니다. “측정” 탭에서 “실행 비디오 수집”에 클릭 선택 실험 (3-5)의 수와 그들 (0 분) 사이의 시간 지연 합니다. (개별 subvolume-) 위치 (11) 수와 입자를 분석 해야 합니다 어디 각 측정 위치에서 (측정) 주기 (10) 수 정의 폴더를 선택 하 고 새 파일 이름을 만들 “확인”을 클릭 측정 시작. 4입니다. 결과의 해석 측정 후 “분석” 탭에서 매개 변수 및 결과 볼. 셀 채널을 청소 하기 전에 분석 후 다음 매개 변수를 확인 하십시오: 위치, 추적된 입자와 입자 농도, 입자 (x10, x50, 및 x90 값)의 분포 폭의 총 수 입자의 평균 수의 값 평균 그리고 표준 편차입니다. 필요한 경우 샘플의 측정을 반복 합니다.참고: 결과.pdf 또는.txt 파일로 저장 됩니다. “분석” 탭 그래프 크기에 의해 검색 된 입자의 분포를 보여주는 측정 후 계산을 클릭 합니다. “분석” 탭에서 “디스플레이”를 클릭 하 고 아이콘을 사용 하 여 조정 하 고 특정 요구 사항에 대 한 그래프 설정을 변경. 5. 유효성 검사 통해 EV 탐지 부 럽에 의해 EV 펠 릿 (1 단계에서 준비) RIPA 세포와 추출 버퍼에 해산 하 고, 철저 하 게 플라스틱 lysate를 명확히 하는 상쾌한 새로운 튜브에 전송 30 분 4 ° C에서 10 분 원심 분리기 8000 x g 에서 샘플에 대 한 얼음에 품 어. Lowry 단백질 분석 실험 키트를 총계 단백질을 측정 한다. RIPA 버퍼의 49 μ와 격리 된 EV 서 스 펜 션의 1 μ를 희석 하 고 분석을 위한 triplicates의 5 μ를 사용 합니다. 2 µ g/μ와 95 ° c.에서 10 분 동안 열의 최종 농도에 2 x Laemmli 로딩 버퍼와 EV 정지 희석 잘 당 단백질의 20 μ g를 로드 합니다. 고 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 및 탱크 표준 프로토콜에 따라 blotting에 의해 단백질을 전송 합니다. RT에 1 시간에 대 한 소 우유 분말 (5%)와 막 (0.2 μ m polyvinylidene difluoride)를 차단 하 고 특정 기본 항 체 (CD9, CD63, 및 vimentin) 4 ° c.에 하룻밤을 막 품 어참고: 기본 항 체 1:1,000 희석에 사용 됩니다. TBST 가진 막 씻고 3 x 5 분 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 막 품 어 고-실시간에서 60 분에 대 한 활용 된 이차 항 체 (1:20, TBST에 000) TBST 가진 막 씻고 3 x 5 분 이미징 시스템에 높은 감도 기판 솔루션 화학에 의해 단백질을 검출 하 고.참고: 때문에 CD63 항은 광범위 하 게 변함없이 당화, 분자량에 다를 수 있습니다, 그리고 밴드 40-65 kDa 사이 나타날 수 있습니다.