Быстрое на основе флуоресценции характеристика одной внеклеточного везикулы в крови человека с анализом наночастиц отслеживание
Summary
В этом протоколе мы описываем полный рабочий процесс для быстрой изоляции внеклеточного везикулы от человека цельной крови и характеризация конкретных маркеров путем анализа на основе Флуоресценция наночастиц отслеживания. Представленные результаты показывают высокий уровень воспроизводимости и может быть скорректирована в supernatants культуры клеток.
Abstract
Внеклеточные везикулы (EVs), включая exosomes, являются специализированными мембранное нано размера везикулы в жидкостях, которые конститутивно освобождаются от многих типов клеток и играть ключевую роль в регулировании ячеек коммуникации и широкий спектр биологические процессы. Были описаны многие различные методы для определения характеристик EVs. Однако большинство из этих методов имеют тот недостаток, что подготовка и квалификация образцов очень много времени, или чрезвычайно трудно проанализировать конкретные маркеры интерес из-за их малого размера и из-за отсутствия дискретных населения. Хотя за последнее десятилетие были значительно усовершенствованы методы для анализа EVs, есть еще не стандартизированный метод для характеристики одного EVs. Здесь мы демонстрируем полуавтоматический метод для характеризации одно электромобилей путем анализа на основе Флуоресценция наночастиц отслеживания. Протокол, который представлен адреса общей проблемой многих исследователей в этой области и предоставляет полный рабочий процесс для быстрой изоляции EVs и характеристика PKH67, компоновщик общей клеточной мембраны, а также с конкретными поверхностных маркеров как CD63, CD9, виментин и лизосомальных связанные мембранный белок 1 (лампа-1). Представленные результаты показывают высокий уровень воспроизводимости, что подтверждается другими методами, например Западный blotting. В проведенных экспериментах мы использовали исключительно EVs, изолированных от образцов сыворотки крови человека, но этот метод также подходит для плазмы или другими жидкостями организма и может быть скорректирована для характеризации EVs от supernatants культуры клеток. Независимо от будущего хода исследования по биологии EV протокол, который представлен здесь обеспечивает быстрый и надежный метод для быстрого характеристика одно электромобилей с конкретными маркерами.
Introduction
Внеклеточные везикулы (EVs), включая exosomes, являются специализированными мембранное нано размера везикулы (20-150 Нм) содержащие определенные комбинации липиды, адгезии и межклеточных сигнальных молекул, а также другие функциональные цитозольной компоненты как микроРНК (miRNA) и мРНК и играть ключевую роль в регулировании ячеек коммуникации1,2. EVs выпускаются в их среде из многих различных типов клеток, например, эндотелиальные клетки, клетки иммунной системы и опухолевых клеток и может быть обнаружен в жидкостях организма как сыворотки спермы, мочи, грудное молоко, слюна или спинномозговой жидкости3, 4. увеличение числа исследований подчеркивают разнообразные вклад EVs в качестве потенциальных биомаркеров для ранней диагностики нескольких заболеваний и/или прогноз болезнь прогрессии5,6. Exosomes часто характеризуются присутствие молекул, которые они конкретно связаны с, независимо от типа ячейки, которую они получают от7. К примеру, exosomes содержат различные tetraspanins (CD9, CD63, CD81), основной комплекс гистосовместимости класса я (MHC я) молекулы, различные трансмембранные белки, типичный цитозольной белки (тубулин и миозина), молекул, участвующих в multivesicular тело ( Блок измеряемых величин) биогенеза (TSG101 и Аликс), тепло белки шока (HSP 70 и HSP 90), и белки, которые участвуют в сигнала трансдукции (протеинкиназы)8.
Были описаны различные методы для характеризации EVs9. Наиболее распространенный и широко распространены методы, используемые для анализа EV являются потока цитометрии10, сканирование электронная микроскопия (SEM) и передачи электронной микроскопии (ТЕА)11. Насчитывающий и часто используемый метод для биохимических характеристик EV содержание является западной blotting12,13. В то время как SEM и ТЕА позволяют для обнаружения EVs через весь размерный ряд, весьма ограниченное определение специфических поверхностных белков является особое недостатком этих методов. В противоположность этому, проточной цитометрии является мощным инструментом для выявления конкретных EV поверхностных маркеров, но порог этого метода ограничивает анализ для EVs с размером больше чем 500 Нм. Следовательно анализ изолированных EVs с обнаружением конкретных поверхностных маркеров в настоящее время не доступен через любой из этих трех устоявшихся методов. Мы ранее описанных еще чувствительный метод для визуализации и анализа EVs, наночастиц отслеживания анализа (НТА)14. Вкратце этот метод сочетает в себе два различных физических принципах. Во-первых частицы рассеивают свет, когда они являются облученных лазерный луч, и второй принцип, известный как броуновского движения, подразумевает, что распространение различных частиц в жидкой суспензии обратно пропорциональна их размер. Инструмент анализа полуавтоматические Обои наночастиц для исследования жидких образцов состоит из частиц, отслеживания анализатор с анализа, на основе программного обеспечения, где записываются цифровые изображения рассеянного света от одной частицы. Лазерный микроскоп рассеяния с видео камерой обнаружить движение частиц и частиц. Лазерный луч ориентирован вертикально, в то время как оптической оси горизонтального и сосредоточены в канал ячейки заполнены с образцом. Данные, предоставленные земельные участки рассеянного света пятен и их скорость движения возможность определения общего количества и размера частиц. После облучения лазером, частицы рассеивают свет, который записан цифровой видеокамеры через Микроскоп14. По улучшению нашего бывшего метод является включение 500 нм длиной волны перевал (LWP) отключения фильтра между лазер (длина волны 488 нм) и мобильный канал, который позволяет прямой анализ флуоресцировани обозначенного частиц (рис. 1). Наш протокол рассматриваются общие потребность многих исследователей в этой области быстро характеристика одного EVs, например, согласно их родителей происхождения. В этом протоколе мы описываем полный рабочий процесс для быстрой изоляции EVs от человека цельной крови и быстрая характеристика конкретных маркеров путем анализа на основе Флуоресценция наночастиц отслеживания. EVs могут быть обнаружены путем пятнать с PKH67, компоновщик общей клеточной мембраны, а также с конкретными exosomal маркеров, например, CD63, CD9 и виментин. Наш протокол подходит также для ЭДТА и citrated плазмы, а также других жидкостей организма и supernatants культуры клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы демонстрируем подробный протокол для изоляции EVs от цельной крови и быстрая характеристика конкретных поверхностных маркеров с на основе Флуоресценция наночастиц, отслеживания анализа. В проведенных экспериментах мы использовали исключительно EVs, изолированных от образцов сыворотки, но этот метод также подходит для Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и citrated плазмы и также может быть расширена до других телесных жидкостей, таких как моча, грудное молоко, слюна, спинномозговой жидкости и спермы. Кроме того этот протокол может настраиваться для характеризации EVs от supernatants культуры клеток. В этом протоколе EV подвеска был создан из 100 мкл сыворотки с помощью exosome осадков реагента, который содержит несвободные полимер, который мягко осаждает exosomes и EVs согласно корпускулярная размер в диапазоне от 30 Нм до 200 Нм, whereby 10-20 мкл из EVs были назначены для характеристики каждой поверхности маркера. К сожалению изоляции шаг неизбежен, потому что большое количество белка в образцах сыворотки (например, альбумин и глобулина) вмешивается антитело пятная процедуру и приводит к высоким уровнем фона и сложные выводы. Кроме того на основе биологической доступности exosomes в образцах, количество занятых EV подвески, а также разведение перед обработкой должна корректироваться для других исходных материалов. Чтобы сравнить несколько образцов, необходим стандартизированный подход для разведения образцов, а также параметры последовательного приобретения (чувствительность, затвор и т.д.). Другим важным моментом является не начала измерений до тех пор, пока дрейф является низким (в наших руках, < 5 мкм/s). Если дрейф была слишком высокой, повторные измерения образца принесли высокое стандартное отклонение между собой, но с низкий дрейф, полученные данные были весьма последовательной и подтвердил высокий уровень воспроизводимости. Важно, что выбранный антитела имеют соответствующие флюрохром. Антитела должны проспряганное с Alexa Fluor 488, потому что FITC имеет высокую скорость фото-отбеливания. Возможно более стабильные fluophores безусловно приведет к увеличению пробирного стабильности в будущем. Как правило многие исследователи используют PBS в качестве разбавителя для EVs. Для этого протокола важно использовать дистиллированную воду в качестве разбавителя для суспензий EV. Когда EVs помечены флуоресцентных красителей, высокий осмотического давления и концентрации ионов другими растворителями, например PBS, может мешать измерения и привести к изменить результаты.
Хотя за последнее десятилетие были значительно усовершенствованы методы для анализа EVs, есть еще не стандартизированный метод для изоляции и характеристика EVs. Основным недостатком проточной цитометрии, где EVs часто привязаны к бусины предоставлять большую поверхность, что многие EVs док на поверхность для обеспечения сильной и обнаружить сигнал10. SEM и ТЕА имеют тот недостаток, что подготовка образцов является длительным и EVs можно отличить только по их размер и морфология11. На сегодняшний день, насчитывающий и часто используемый метод для качественного (т.е. биохимические) Характеристика EV это западной blotting, где белки могут быть проанализированы с специфическими антителами12,13. Однако недостатки этих методов лежат в неспособности анализировать одно электромобилей для конкретных поверхностных маркеров. Кроме того долгое время обработки и длинные Стиральная/изоляции процедур используются многие из нынешних протоколов включают трудоемкие шаги, делая их не подходит для высокого образца пропускной способности и характеристика одного EVs. Наш протокол обеспечивает полный рабочий процесс для быстрой изоляции и характеристика одно электромобилей с конкретными поверхностных маркеров, например CD63, CD9, виментин и CD107a и может быть расширена для широкого спектра других поверхностных маркеров, чтобы определить происхождение выпущенные EVs. Из-за постоянного технического прогресса НТА устройства мы подтвердили наши выводы в сотрудничестве с производителем с помощью новейших анализатора. Независимо от будущего хода исследования по биологии EV, особенно относительно exosomes протокол, который представлен здесь обеспечит быстрый и надежный метод для характеризации одно электромобилей с конкретными маркерами. Потому что агрегирование EVs в изоляции и окрашивание процедуры пока является неизбежным, будущие исследования должны сосредоточиться на разработке методов для предотвращения агрегации EV и позволить для определения точного размера люминесцентные меченых EVs.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят частиц Metrix GmbH для частично покрытия расходов на публикацию этой работы.
Materials
| Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
| Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
| Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
| Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
| Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
| Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
| Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
| Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
| Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
| Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
| Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
| Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
| CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
| FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
| CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
| Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
| Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
| Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
| Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |
References
- Ibrahim, A., Marban, E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology. Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).
- Su, S. A., et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling. Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, 9 (2011).
- Li, M., et al. Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Lin, J., et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. The Scientific World Journal. 2015, 657086 (2015).
- Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. Exosomes: the future of biomarkers in medicine. Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes. Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments. (95), 50974 (2015).
