マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

すべての動物実験は、国立がん研究所(NCI)の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、NIHガイドラインに従って行われました。 1. iPSCとの共培養のためのOP9/DLL1細胞の調製 OP9培地における培養OP9/DLL1細胞(α-最小必須培地[α-MEM]+20%非熱不活性化胎児ウシ血清[FBS]+1xペニシリン連鎖筋リン+アスコルビン酸[50 ng/mL]およびモノチオグリセロール[100 nM])を37°Cで培養した。OP9/DLL1細胞が80~95%の合流性に達した場合は、1xマグネシウム、カルシウム、フェノール赤フリーリン酸緩衝生理食塩分(以下、PBSといいます)で1回洗浄してください。 0.05%トリプシンの4 mLを追加し、37°Cで5分間インキュベートします。次いで、OP9培中の4mLを添加し、ピペッティングにより細胞層を解離し、単一のセル懸濁液を作る。 100 μm セル ストレーナーを介して 50 mL 円錐管にセル懸濁液を移します。4°Cで5分間300xgで遠心分離機を、上清を吸引し、OP9培体の12mLで再中断する。 OP9/DLL1細胞懸濁液のプレート2 mLを新しい10cm細胞培養ペトリ皿に加え、OP9培地の8mLを追加します。2~3日ごとに繰り返します。注:FBSおよび培養条件の質は、iPSC分化をサポートする能力を失うことなくOP9/DLL1細胞の膨張を維持するために重要である。したがって、細胞分化および老化を防ぐために、80%の合流性で一貫してFBSと通過の多くを事前に評価することをお勧めします。また、OP9/DLL1細胞の十分な冷凍ストックを作り、4~6週間ごとに新しいストックを解凍することも重要です。 2. 未熟T細胞へのiPSCの体外分化 0日目に、OP9/DLL1コンフルエント料理でiPSC共培養を開始します。 トリプシン化による単一細胞懸濁液としてiPSCを収穫し(37°Cで0.05%トリプシンで5分)、細胞を回収し、遠心分離機を4°Cで5分間300xgで回収する。 OP9培体の10mL当たり1.0 x 105 iPSCで細胞を吸引し、再中断する。プレート 1.0 x 105 iPSC を CONフルエント OP9/DLL1 10 cm 皿に付けます。注:OP9/DLL1 10cmの料理は、90~100%の合流率に達するとiPSC分化に使用されます。合流の違いは、iPSC分化の効率に影響を与える可能性があります。 3日目に、古いメディアを吸引し、新鮮なOP9メディアの10 mLに置き換えます。 6日目に、通過細胞。 PBSの10 mLで各10 cmコンフルエントOP9皿を洗います。皿あたり0.05%トリプシンの3 mLを追加し、室温(RT)で3-5分間インキュベートします。 OP9培体の4mLを追加し、穏やかなピペッティングで細胞を収集します。100 μm のセル ストレーナーと遠心分離機を 300 x gで 4 °C で 5 分間渡します。上清を捨てる。 分化媒体の10mLで細胞を再懸濁(5 ng/mLマウスFlt3リガンド[FLT3L]および5 ng/mLマウスIL-7を用いてOP9培地およびプレートセル懸濁液を新しい10cm OP9/DLL1コンフルエント皿に置き換える。 9日目に、古いメディアを吸引し、新鮮な分化メディアの10 mLに置き換えます。 iPSCコロニーで心筋細胞が観察された11日目に、ピペッティングによって非付着細胞を機械的に剥離し、100μmの細胞ストレーナーを通して濾過する。300 x gで5分間4°Cでスピンします。 上清を吸引し、分化媒体の24 mLで再中断する。confluent OP9/DLL1 6ウェルプレート(4 mL/ウェル)にiPSCをプレートします。 15日目に、すべての非付着細胞を収集し、40 μmセルストレーナーを通して濾過します。 300 x gで5分間4°Cでスピンします。 ステップ2.5.1を繰り返して、3~4日ごとに非付着細胞の通過を続けます。 3. iTEを生成する3D胸腺臓器培養 マウスの胎児胸腺ローブを収穫し、前述の16としてデオキシグアノシン(dGUO)治療による内因性リンパ球の展開。 dGUO処理の7日目に、4つの新しい10cmの皿を取り、完全な媒体の20 mLでそれぞれを満たします(ロスウェルパーク記念研究所メディア1640 [RPMI 1640]+10S +1x L-アラニル-L-グルタミン+1xナトリウムピルビン酸+1x必須必須アミノ酸を含む1x最小必須培地(MEM-NEAA)+1xペニシリン連鎖マイシン+[1:1000]2-メルカプトエタノール) 胸腺ローブを持つすべてのニトロセルロース膜を1つの10センチメートルの皿に移します。個々の葉を鉗子で膜から取り外し、メディアに浸かるようにします。膜を捨てるRTで1時間インキュベートします。 胸腺ローブを完全なメディアで新しい10cmの皿に移し、RTで1時間インキュベートします。 鉗子を使用して、甲状腺ローブを皿に固定し(一度に1つずつ)、もう一方の手で中央に100〜200 μmの深い切開を行い、ローブの直径の半分を拡張して、T細胞前駆子の葉への移動を容易にする。 完全な分化媒体で満たされた新しい10cmの皿に胸腺ローブを移す(完全な媒体+ 5 ng/mLマウスIL-7 + 5 ng/mLマウスFLT3L+ 5 ng/mL SCF)。 必要に応じて、下部および上位のグリッドを持つ 3D 培養プレートを使用する場合は、両方のグリッドを滅菌 PBS で塗りつぶして、吊り下げ滴の蒸発と乾燥を防ぎます。 ステップ3.6から1つのdGuo処理された胸葉を含む完全な培地の30 μLを3D培養プレートの各ウェルに移します。 OP9/DLL1共培養(16~21日目)(ステップ2.6.2)から非付着性T系統細胞(iPSC由来未熟T細胞)を集め(ステップ2.6.2)、20μL培地当たり2-5 x 103 T系細胞で再中断する。 3D培養プレートの各胸葉に20μLのT系統細胞懸濁液を加えます。5%CO 2で37°Cで一晩インキュベートします。 P200ピペを30μLに設定し、各井戸から数回ピペッティングした後、甲状腺ローブを囲むすべての細胞を取り除く後、メディアを吸引します。メディアを破棄し、30 μL の完全なメディアを追加します。この手順を5~7回繰り返し、ローブに移行しない余分な未熟なT細胞を除去します。その後、メディアの25~30 μLを毎日変更します。 4~5日目に始まるローブの周りにiPSC由来の胸腺移民(iTE)のハローの形成を光顕微鏡で確認する。 ローブの中断なしでメディアをピペッティングすることにより、毎日iTEを収集します。毎日メディアを変更し、約12日間まで収集を続けます。 収穫されたiTEは、分子解析(図2、図3、図4、図5)または生体内移植実験に使用する準備ができています。 4. 抗原提示細胞の調製(APC) 頸部脱臼によるC57BL/6マウスを犠牲にし、上述したようにラボソーカーマットの上に置きます。 脾臓を取り出し、100 μm のセル ストレーナーの上に置く。12 mLシリンジプランジャーを使用して脾臓をストレーナーに圧縮し、単一の細胞懸濁液を作ります。 無菌の40 μmセルストレーナーを介して細胞懸濁液を移す。懸濁液を300 x gで5分間4°Cで遠心分離し、細胞をペレットする。 上清を吸引し、赤血球(RBC)を排除するために、塩化カリウム(ACK)リシスバッファーの2 mLで細胞ペレットを再中断する。RTで5分間インキュベートします。 10 mLのPBSを添加してACKリシスバッファーをクエンチする。4°Cで5分間300xgで遠心分離によって細胞をペレットする。 上清を吸引し、完全な培養剤の10 mLで細胞ペレットを再懸濁し、10 cmの無菌ペトリ皿に移す。 細胞増殖を防ぐために照射装置(γ放射線)を用いて3500ラッドの脾細胞を照射する。 照射した細胞を直ちに37°Cインキュベーターに戻し、一晩培養する。 照射されたセルを APC として使用するか、セルバンカーで凍結します。 5. 抗原を使ったAPCのパルス ノイバウアーヘモサイトメーターとトリパンブルー染料を使用して、ライブ照射APCをカウントします。ペプチド(hgp100)またはヌクレオタンパク質でAPCを37°Cで30分間インキュベートします。 余分なペプチドを除去するために、PBSの10 mLでAPCを2回洗浄します。 iTE をカウントし、100 IU IL-2 および 5 ng/mL IL-7 を持つ完全なメディアで 1:1 の比率で APC と混合します。アリコット100μLの細胞混合物(総濃度:1x 106細胞/mL)を、37°Cで48時間の超低アタッチメントUボトム96ウェルプレートおよび培養の各ウェルに入れる。 48時間後、マルチチャンネルピペットを使用して新しいプレートに細胞を移し、その後2~3日ごとに通過する。 3日目に細胞内抗体を染色してサイトカイン分泌プロファイルを分析し、フローサイトメトリー(図3)で分析する。 タンパク質輸送阻害剤の0.67 μL/mLを追加し(例えば、GolgiStop)、サイトカインの細胞内蓄積を高めるために6時間37°Cでインキュベートします。10 mLのPBSで洗浄します。 3 mLの冷たい(4°C)PBSで細胞を再中断し、ゆっくりと冷たい4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液の1 mLを追加します。 10分後、4°Cで5分間300xgで細胞をスピンダウンし、上清を捨て、10 mLのPBSで洗浄します。 1 mL PBS + 1% FBS + 0.1% ニオニオン界面活性剤で細胞を再中断し、10〜15分間4°Cに置きます。 抗体を追加し、光からサンプルを保護し、30分間4°Cに置きます。 4°Cで5分間300xgで細胞をスピンダウンし、上清を捨て、10mLのPBSで洗浄する。 4°Cで5分間300xgで細胞をスピンダウンし、PBSの1 mLで細胞を再中断します。 細胞は流れ細胞計で分析する準備ができている。