תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים וועדות השימוש של המכון הלאומי לסרטן (NCI) והופיע בהתאם הנחיות NIH. 1. הכנת תאים OP9/DLL1 עבור תרבות שיתוף עם iPSC תרבות OP9/DLL1 תאים ב-OP9 מדיה (α-בינוני חיוני מינימלי [α-הגברת] + 20% ללא חום סרום העוברי בלתי מופעל [FBS] + 1x פניצילין-סטרפטומיצין + החומצה האסקורבית [50 ng/mL] ו-מונו-תאיוגלינול [100 nM]) ב 37 ° c. כאשר OP9/DLL1 תאים להגיע 80-95% השטף, לשטוף פעם אחת עם מגנזיום 1x, סידן, ו פנול אדום חינם פוספט באגירה מלוחים (להלן המכונה PBS). הוסף 4 מ ל של 0.05% טריפסין ו דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c. לאחר מכן להוסיף 4 מ ל של OP9 מדיה, הנתק את שכבת התא על ידי ליטוף לעשות השעיה תא אחד. להעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 mL באמצעות מסננת תא 100 יקרומטר. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, משאכל את סופרנטאנט, ומשהה מחדש ב 12 מ ל של מדיה OP9. צלחת 2 מ ל של OP9/DLL1 cell הבולם על חדש 10 ס”מ התרבות התא צלחת פטרי להוסיף נוספים 8 מ ל של OP9 מדיה. חזור על מעבר מדי יומיים עד 3 ימים.הערה: האיכות של FBS ותנאי התרבות הם קריטיים כדי לשמור על התרחבות של OP9/DLL1 תאים מבלי לאבד את היכולת שלהם תמיכה iPSC בידול. לכן, מומלץ להעריך מראש את הרבה FBS ומעבר בעקביות ב 80% השטף כדי למנוע בידול התא והזדקנות. חשוב גם לעשות מספיק מלאי קפוא של OP9/DLL1 תאים ולהפשיר מלאי חדש כל 4 – 6 שבועות. 2. בבידול חוץ גופית של iPSC אל תאים T בוגרים ביום 0, התחילו שיתוף תרבות iPSC על מאכלים OP9/DLL1 confluent. בציר iPSC כמו תא אחד השעיה על ידי טריסיזציה (5 דקות ב 0.05% טריפסין ב 37 ° c), לאסוף את התאים, ואת צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. משף את התאים האלה ומשהה מחדש ב-1.0 x10ipsc לכל 10 mL של מדיה OP9. פלייט 1.0 x 105 ipsc על a CONFLUENT OP9/DLL1 10 ס מ צלחת.הערה: OP9/DLL1 10 מנות ס מ משמשות לבידול iPSC כאשר הם מגיעים 90-100% שטף. הבדלים בשטף יכול להשפיע על היעילות של iPSC בידול. ביום 3, מאכלת מדיה ישנים ולהחליף עם 10 מ ל של OP9 מדיה טריים. . ביום 6, בתאי מעבר כביסה כל 10 ס מ confluent OP9 צלחת עם 10 מ ל של PBS. הוספת 3 מ ל של 0.05% טריפסין לכל מנה ומודטה עבור 3 – 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הוסף 4 מ ל של OP9 מדיה ולאסוף תאים על ידי ליטוף עדין. להעביר תאים דרך מסננת תא 100 יקרומטר ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . להיפטר מסופרנטאנט להשעות את התאים ב 10 מ ל של בידול מדיה (OP9 מדיה עם 5 ng/ml Flt3 ליגנד [FLT3L] ו 5 ng/ml העכבר IL-7) ואת התא צלחת ההשעיה אל חדש 10 ס מ OP9/DLL1 הצלחת confluent. ביום 9, מותיקים את המדיה הישנה ומחליפים עם 10 מ ל של מדיה בידול טרי. ביום 11 כאשר קרדיוציטים הם נצפו במושבות ipsc, ניתוק מכני תאים שאינם מחסיד על ידי ליטוף ולסנן דרך מסננת תא 100 יקרומטר. ספין ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. ומשהה מחדש 24 מ ל. של בידול מדיה הלוח iPSC לתוך confluent OP9/DLL1 6-בסדר צלחת (4 מ”ל/טוב). ביום 15, לאסוף את כל התאים הלא מחסיד ולסנן דרך מסננת תא 40 יקרומטר. ספין ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. המשך לדרוך על התאים הלא-מחסיד כל 3 עד 4 ימים על-ידי 2.5.1 צעד חוזר. 3.3D הרתי עוגב תרבות כדי ליצור הניט הקציר העכבר העוברי האונות ולפרוס של לימפוציטים אנדוגניים ידי deoxyguanosine (dGUO) הטיפול כפי שתוארה בעבר16. ביום 7 של הטיפול dGUO, לקחת ארבעה חדשים 10 ס מ מנות ולמלא כל אחד עם 20 מ ל של מדיה מלאה (Rosswell פארק הזיכרון המכון מדיה 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanyl-ל-גלוטמין + 1x נתרן פירובט + 1x בינוני חיוני מינימלי עם חומצות (הגברת-NEAA) + 1x פניצילין-סטרפטומיצין + [1:1000] 2-mercapto אתנול). העבר את כל הממברנות תאית עם האונות הרתי לתוך 1 10 ס”מ צלחת. ניתוק האונות הבודדות מן הקרום עם מלקחיים, מה שמאפשר להם להיות שקוע במדיה. . להשליך את הקרומים . מודטה בשביל 1 h ב-RT העבר את האונות הרתי לצלחת חדשה 10 ס מ עם מדיה שלמה ו-מודטה עבור 1 h ב RT. חזור על שלב זה 2 פעמים נוספות. באמצעות מלקחיים, לתקן את האונות הרתי אל המנה (אחד בכל פעם), עם היד האחרת לעשות 100-200 יקרומטר חתך עמוק במרכז והארכת חצי קוטר האונה כדי להקל על הגירה תא מחולל T לתוך האונה. העברת האונות הרתי למנה חדשה 10 ס מ מלא מדיה בידול מלא (מדיה מלאה + 5 ng/mL העכבר IL-7 + FLT3L ng/mL העכבר + 5 ng/mL SCF). באופן אופציונלי, אם משתמשים בלוחות תרבות תלת-ממדיים עם רשתות ברמה נמוכה יותר, מלא את שתי הרשתות עם ה-PBS הסטרילי כדי למנוע אידוי וייבוש של טיפות תלויות. העברה 30 μL של מדיה מלאה המכילה האונה הרתי dGuo מטופלים אחד משלב 3.6 לתוך כל טוב של צלחת התרבות 3D. לאסוף שאינם חסיד תאים שושלת היוחסין (iPSC-נגזר תאים T בוגרים) מ OP9/DLL1 שיתוף התרבות (ימים 16-21) (שלב 2.6.2) ו להשעות ב 2 – 5 x 103 תאים השושלת T לכל 20 מדיה μl. הוסף 20 μL של השעיית תא השושלת T לאונה כל הרתי בצלחת התרבות התלת-ממדית. דגירה לילה ב 37 ° צ’ עם 5% CO2. להגדיר את P200 pipet 30 μL ו לבשל את התקשורת לאחר ליטוף מספר פעמים מכל טוב כדי להסיר את כל התאים המקיפים את האונות הרתי. למחוק מדיה ולהוסיף 30 μL של מדיה מלאה. חזור על הליך זה 5 – 7 פעמים כדי להסיר כל התאים T בוגרים נוספים אשר אינו להגר לתוך האונות. שינוי 25 – 30 μL של מדיה מדי יום לאחר מכן. לאשר את היווצרות של הילה של מהגרים הרתי iPSC הנגזר (iTE) סביב האונות החל ביום 4 – 5 על ידי מיקרוסקופ אור. לאסוף את הקיט מדי יום על ידי ליטוף מדיה ללא הפרעה באונה. שנה מדיה כל יום והמשך לאסוף עד 12 ימים בקירוב. הניט שנקטפו מוכנים לשימוש עבור ניתוחים מולקולריים (איור 2, איור 3, איור 4, איור 5) או בניסויים vivo השתלת. 4. הכנת תאים אנטיגן המציג (APC) להקריב עכבר C57BL/6 על ידי פריקה צוואר הרחם מקום על מחצלת פלסטרים מעבדה כמתואר לעיל. להסיר את הטחול ולמקם אותו על מסננת תא 100 יקרומטר. דחיסת הטחול על המסננת באמצעות מזרק 12 מ ל כדי ליצור תא השעיה אחת. העברת ההשעיה התא באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר סטרילי. צנטריפוגה את ההשעיה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ’ כדי לצנפה את התאים. משאת הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה בתא 2 מ ל של אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) מאגר לפירוק כדי להוציא את כדוריות הדם האדומות (RBC). דגירה עבור 5 דקות ב RT. כיבוי מאגר הליזה ACK על-ידי הוספת 10 מ ל של PBS. כדור התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. משאת הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה ב -10 מ ל של אמצעי תקשורת מלאים ומעבירים לצלחת פטרי בגודל 10 ס מ. הקרנת טחול עם 3500 rad באמצעות מכשיר הקרנה (קרינה γ) כדי למנוע הפצת תאים. החזר מיד את התאים שעברו לקרינה לחממה ולתרבות של 37 ° c בלילה. השתמש בתאים שעברו הקרינה כמו APC או להקפיא בנקאי התא. 5. פעימות APC עם אנטיגן הרוזן APC חי לקרינה באמצעות הומוציטוטומטר נויבאואר וטריקון צבע כחול. מיכל APC עם פפטידים (hgp100) או נואופלפרוטאין עבור 30 דקות ב 37 ° c. לשטוף APC פעמיים עם 10 מ ל של PBS להסיר כל פפטיד נוסף. לספור iTE ולערבב עם APC ביחס 1:1 במדיה המלאה עם 100 IU IL-2 ו 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 μL של התערובת של תאים (ריכוז סה כ: 1 x 106 תאים/mL) לתוך כל באר של מצורף אולטרה נמוכה התחתון U 96 בצלחת ותרבות עבור 48 h ב 37 ° c. לאחר 48 h, להעביר את התאים לצלחת חדשה באמצעות מעבר הצינורות רב-ערוצי כל 2 – 3 ימים לאחר מכן. ביום 3, לנתח את הפרשת ציטוקינים פרופיל על ידי צביעת התאים עם נוגדן תאיים ולנתח ידי cy, שלוש זרימה (איור 3). הוסף 0.67 μL/mL של מעכב הובלה חלבונים (למשל, GolgiStop) ו-דגירה ב 37 ° צ’ עבור 6 h כדי לשפר את הצטברות תאיים של ציטוקינים. שטוף עם 10 מ ל של PBS. השהה את התאים במהירות של 3 מ ל (4 ° צלזיוס) PBS והוסיפו באיטיות 1 מ ל קר 4% פאראפורמלדהיד. לאחר 10 דקות, לסובב את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, להיפטר supernatant ולשטוף עם 10 מ ל של PBS. השהה תאים מחדש ב-1 מ”ל PBS + 1% FBS + 0.1% nonionic סטנט, והמקום ב 4 ° c עבור 10 – 15 דקות. הוסף נוגדנים, להגן על דגימות מאור ומקום ב 4 ° c עבור 30 דקות. לסובב את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, למחוק supernatant, ולשטוף עם 10 מ ל של PBS. לסובב את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ו להשעות את התאים מחדש 1 מ ל של PBS. תאים מוכנים להיות מנותח בתוך cytometer זרימה.