Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Tüm hayvan deneyleri Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı ve NIH kurallarına uygun olarak yapıldı. 1. OP9/DLL1 Hücrelerinin iPSC ile Ortak Kültür için hazırlanması OP9 ortamda Kültür OP9/DLL1 hücreleri (α-minimum esansiyel orta [α-MEM] + 20% ısı sızdırmaz fetal sığır serumu [FBS] + 1x penisilin-streptomisin + askorbik asit [50 ng/mL] ve mono-tiyogliserol [100 nM]) 37 °C. OP9/DLL1 hücreleri -95 biraraya geldiğinde, 1x magnezyum, kalsiyum ve fenol kırmızısı serbest fosfat tamponlu salin (bundan böyle PBS olarak anılacaktır) ile bir kez yıkayın. 37 °C’de %0,05 tripsin ve 5 dk inkübatör olmak için 4 mL ekleyin. Daha sonra 4 mL OP9 ortam ekleyin, tek bir hücre süspansiyonu yapmak için pipetleme yaparak hücre tabakasını ayırın. Hücre süspansiyonuna 100 μm’lik bir süzgeçten 50 mL konik bir tüpe aktarın. 4 °C’de 5 dk için 300 x g’de santrifüj, supernatant aspire ve OP9 media 12 mL resuspend. Yeni bir 10 cm hücre kültürü Petri kabı üzerine OP9/DLL1 hücre süspansiyon plaka 2 mL ve OP9 medya ek 8 mL ekleyin. Her 2-3 günde bir geçişi tekrarlayın.NOT: FBS ve kültür koşullarının kalitesi, OP9/DLL1 hücrelerinin iPSC farklılaşmasını destekleme yeteneklerini kaybetmeden genişlemesini sağlamak için çok önemlidir. Bu nedenle, hücre farklılaşmasını ve yaşlanmayı önlemek için FBS ve geçişin ‘inde tutarlı bir şekilde önceden değerlendirilmesi önerilir. Ayrıca OP9/DLL1 hücrelerinin yeterli dondurulmuş stok yapmak ve her 4-6 haftada yeni bir stok çözülmek önemlidir. 2. In Vitro Farklılaşma iPSC Immature T Hücrelerine 0. günde, OP9/DLL1 uyumlu yemeklerinde iPSC ortak kültürüne başlayın. Trypsinizasyon ile tek hücreli süspansiyon olarak hasat iPSC (37 °C’de %0,05 tripsin içinde 5 dk), hücreleri toplayın ve 4 °C’de 5 dk için 300 x g’da santrifüj. OP9 ortamının 10 mL’si başına 1,0 x 105 iPSC’de süpernatant ve resuspend hücreleri aspire edin. Plaka 1.0 x 105 iPSC bir confluent OP9/DLL1 10 cm çanak üzerine.NOT: OP9/DLL1 10 cm’lik yemekler % 90-100 biraraya geldiklerinde iPSC farklılaşması için kullanılır. Birleşim farklılıkları iPSC farklılaşmasının verimliliğini etkileyebilir. 3. günde, eski medyayı aspire edin ve 10 mL taze OP9 ortamla değiştirin. 6. günde, geçit hücreleri. Her 10 cm’lik op9 kabını 10 mL PBS ile yıkayın. Çanak başına %0,05 tripsin 3 mL ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika (RT) kuluçkaya yatırın. 4 mL OP9 ortam ekleyin ve hücreleri nazik pipetleme ile toplayın. Hücreleri 100 μm’lik bir hücre süzgecive santrifüjden 300 x g’de 4 °C’de 5 dk geçirin. Supernatant atın. 10 mL farklılaşma ortamındaki hücreleri (OP9 media, 5 ng/mL fare Flt3 ligand [FLT3L] ve 5 ng/mL fare IL-7) ve plaka hücresi süspansiyonu yeni 10 cm OP9/DLL1 konakıcı çanak üzerine uzaklaştırın. 9. günde, eski medyayı aspire edin ve 10 mL taze farklılaşma ortamı ile değiştirin. IPSC kolonilerinde kardiyomiyositler gözlendiğinde 11. 4 °C’de 5 dk için 300 x g’da döndürün. Süpernatant aspire ve farklılaşma ortamının 24 mL resuspend. Plaka iPSC bir confluent OP9/DLL1 6-well plaka (4 mL /iyi). 15. günde, tüm yapışık olmayan hücreleri toplayın ve 40 μm’lik hücresüzden süzün. 4 °C’de 5 dk için 300 x g’da döndürün. 2.5.1 adımLarını tekrarlayarak her 3-4 günde bir yapışık olmayan hücreleri geçirmeye devam edin. 3. 3D Timik Organ Kültürü iTE oluşturmak için Hasat fare fetal timik loblar ve deoksiguanozin tarafından endojen lenfositlerin dağıtmak (dGUO) daha önce açıklandığı gibi16. DGUO tedavisinin 7. (MEM-NEAA) + 1x penisilin-streptomisin + [1:1000] 2-mercapto etanol). Timik loblar ile tüm nitroselüloz membranları 10 cm’lik bir tabağa aktarın. Tek tek lobları membrandan forceps ile ayırArak ortama daldırılmalarını bekleyin. Zarları atın. RT’de 1 saat kuluçka. Timik lobları tam ortamlı 10 cm’lik yeni bir tabağa aktarın ve RT’de 1 saat kuluçkaya yatırın. Forseps kullanarak, çanak (birer bir) için timik loblar düzeltmek ve diğer taraftan merkezinde 100-200 μm derin kesi yapmak ve lob t hücre atası göçü kolaylaştırmak için lob çapının yarısını genişleterek. Timik lobları tam bir farklılaşma ortamıyla dolu yeni bir 10 cm’lik bir tabağa aktarın (tam ortam + 5 ng/mL fare IL-7 + 5 ng/mL fare FLT3L + 5 ng/mL SCF). İsteğe bağlı olarak, alt ve üst düzey ızgaralara sahip 3B kültür plakaları kullanıyorsanız, asılı damlaların buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için her iki ızgarayı da steril PBS ile doldurun. Adım 3.6’dan 3D kültür plakasının her kuyuya bir dGuo-treated timik lob içeren tam 30 μL’lik tam ortam aktarın. OP9/DLL1 eş kültüründen (16-21 gün) (adım 2.6.2) yapışık olmayan T soy hücrelerini (iPSC kaynaklı olgunlaşmamış T hücreleri) toplayın ve 20 μL ortam başına 2-5 x 103 T soy hücrelerinde yeniden askıya alın. 3B kültür plakasındaki her bir timik loba 20 μL T soy hücresi süspansiyonu ekleyin. Bir gecede %5 CO2 ile 37 °C’de kuluçkaya yatırın. P200 pipetini 30 μL’ye ayarlayın ve timik lobları çevreleyen tüm hücreleri temizlemek için her kuyudan birkaç kez pipetleme yaptıktan sonra ortamı aspire edin. Ortamı atın ve 30 μL tam ortam ekleyin. Loblara göç etmeyen ekstra olgunlaşmamış T hücrelerini çıkarmak için bu işlemi 5-7 kez tekrarlayın. Bundan sonra her gün 25-30 μL’lik bir ortam değiştirin. Işık mikroskobu ile 4-5 gün başından itibaren lobların etrafında iPSC kaynaklı timik göçmenlerin (iTE) bir hale oluşumunu doğrulayın. Lob kesintisi olmadan medya borulama tarafından günlük iTE toplamak. Ortamı her gün değiştirin ve yaklaşık 12 güne kadar toplamaya devam edin. Hasat edilen iTE moleküler analizler(Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4ve Şekil 5) veya in vivo transplantasyon deneyleri için kullanıma hazırdır. 4. Antijen Sunum Hücrelerinin Hazırlanması (APC) Servikal çıkış ve yukarıda açıklandığı gibi bir laboratuvar soaker mat üzerine yerleştirin tarafından bir C57BL/6 fare kurban. Dalağını çıkarın ve 100 μm’lik bir hücre süzgecinin üzerine yerleştirin. Tek hücreli süspansiyon yapmak için 12 mL şırınga pistonkullanarak dalağını süzgeçüzerine sıkıştırın. Hücre süspansiyonuna steril 40 μm hücreli süzgeçten aktarın. Hücreleri peletlemek için 4 °C’de 5 dk için 300 x g’de süspansiyonu santrifüj edin. Kırmızı kan hücrelerini (RBC) dışlamak için amonyum-klorür-potasyum (ACK) lisis tamponunun 2 mL’lik kısmını aspire edin ve hücre peletini yeniden askıya alın. RT 5 dakika kuluçka. 10 mL PBS ekleyerek ACK lisis tamponu söndürün. 4 °C’de 5 dk için 300 x g’da santrifüj ile hücreleri pelet. Supernatant aspire ve tam medya 10 mL hücre pelet resuspend ve 10 cm steril Petri kabına aktarın. Hücre çoğalmasını önlemek için bir ışınlama cihazı (γ-radyasyon) kullanarak 3500 rad ile splenositışınışın. Hemen ışınlanan hücreleri bir gecede 37 °C’lik bir kuluçka makinesine ve kültüre geri döndürün. Işınlanmış hücreleri APC olarak kullanın veya hücre bankerinde dondurun. 5. Antijen ile APC Pulsing Neubauer hemositometre ve trypan mavi boya kullanarak Canlı ışınlanmış APC sayMak. 37 °C’de 30 dakika boyunca peptidler (hgp100) veya nükleoprotein ile Incubate APC. Herhangi bir ekstra peptid kaldırmak için 10 mL PBS ile APC’yi iki kez yıkayın. 100 IU IL-2 ve 5 ng/mL IL-7 ile tam ortamda 1:1 oranında iTE’yi sayın ve APC ile karıştırın. Aliquot 100 μL hücre karışımı (toplam konsantrasyon: 1 x 106 hücre/mL) ultra-düşük eki U alt 96 iyi plaka ve kültür her kuyu içine 48 h için 37 °C. 48 saat sonra, çok kanallı pipet ve geçiş kullanarak yeni bir plaka için daha sonra her 2-3 gün hücreleri aktarın. 3. günde, hücreleri hücre içi antikorla boyanarak sitokin sekresyon profilinianaliz edin ve akış sitometrisi ile analiz edin (Şekil 3). 0.67 μL/mL protein taşıma inhibitörü (örneğin, GolgiStop) ekleyin ve sitokinlerin hücre içi birikimini artırmak için 37 °C’de 6 saat kuluçkaya yatırın. 10 mL PBS ile yıkayın. 3 mL soğuk (4 °C) PBS’deki hücreleri yeniden askıya alın ve yavaş yavaş 1 mL soğuk %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi ekleyin. 10 dakika sonra hücreleri 300 x g’de 4 °C’de 5 dk’da aşağı doğru çevirin, süpernatant atın ve 10 mL PBS ile yıkayın. 1 mL PBS + %1 FBS + %0.1 niyonik yüzey aktif maddedeki hücreleri yeniden askıya alın ve 10-15 dk boyunca 4 °C’ye yerleştirin. Antikorekleyin, numuneleri ışıktan koruyun ve 4 °C’de 30 dakika boyunca yerleştirin. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 x g’de hücreleri aşağı doğru çevirin, süpernatantatın ve 10 mL PBS ile yıkayın. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 x g’de hücreleri aşağı doğru çevirin ve 1 mL PBS’de hücreleri yeniden askıya alın. Hücreler akış sitometresinde analiz edilmeye hazırdır.