Summary
Realtid kvantitativa polymerase chain reaktion analys i kombination med omvänd Transkription (RT-qPCR) har använts att mäta nivån av RNA-virusinfektioner. Här presenterar vi en direkt RT-qPCR-analys, som inte kräver ett RNA reningssteg, utvecklat för kvantifiering av flera RNA virus, inklusive denguefeber virus.
Abstract
För närvarande realtid polymeras-kedjereaktion (PCR) teknik är ett oumbärligt verktyg för identifiering och kvantifiering av virala genomer i forskningslaboratorier samt för molekylär diagnos, på grund av dess känslighet, specificitet, och bekvämlighet. Dock i de flesta fall, kvantitativ PCR (qPCR) analysen allmänt används för att upptäcka virusinfektion har förlitat sig på rening av viral nukleinsyra före steget PCR. I denna studie utvecklas fluorescens-baserade omvänd Transkription (RT-qPCR) qPCR analysen genom en kombination av en bearbetning buffert och en one-step RT-PCR reagens så att hela processen, från skörden av kultur supernatanten av virusinfekterade cellerna fram till realtid detektering, kan utföras utan viral RNA rening. Etablerade protokollet möjliggör kvantifiering av ett brett utbud av RNA koncentrationer av denguefeber virus (DENV) inom 90 min. Dessutom demonstreras anpassningsförmåga hos direkt RT-qPCR-analys till utvärderingen av ett antiviralt medel av ett in vitro- experiment med en tidigare rapporterade DENV hämmare, mykofenolsyra (MPA). Dessutom kan andra RNA-virus, inklusive gula febern-virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV) och mässlingvirus (MeV), kvantifieras genom direkta RT-qPCR med samma protokoll. Den direkt RT-qPCR-analys som beskrivs i denna rapport är därför användbar för övervakning av RNA-virus replikeringen på ett enkelt och snabbt sätt, vilket kommer att vidareutvecklas till en lovande plattform för en high-throughput screening-undersökningen och klinisk diagnos.
Introduction
Släktet Flavivirus av flavivirus -familjen omfattar mer än 70 höljeförsedda, positiv-stranded RNA-virus som överförs av myggor och fästingar. Ännu viktigare, leder flavivirus infektion hos människor ofta till svår klinisk sjukdom, såsom hemorragisk feber och encefalit1. Faktiskt, ett senaste utbrott av zikaviruset (ZIKV), ett flavivirus, spridit sig explosionsartat i hela Amerika och har visat sig vara associerade med neurologiska komplikationer, inklusive mikrocefali2,3. Flavivirus, har därför betydande kliniska och ekonomiska inverkan på det moderna samhället.
En viktig flavivirus är denguefeber virus (DENV), en moskitburen virus spridda i de tropiska och subtropiska områdena i världen. DENV överförs av Aedes myggor, inklusive Aedes albopictus och Aedes aegypti, vilket resulterar i den globala spridningen av denguefeber utbrott4. För närvarande, den Världshälsoorganisationen (WHO) klassificerar denguefeber sjukdom som tre kategorier: dengue utan varningssignaler, denguefeber med varningsskyltar och svår denguefeber4. Även om primära infektion med en av de fyra serotyperna av DENV (DENV-1 till -4) är ofta asymtomatiska eller självbegränsande, har epidemiologiska studier visat att sekundära infektionen av olika serotyper ökar risken för mer allvarliga former av denguefeber. Det är värt att notera att antikroppsberoende förstärkning av DENV infektion som orsakas av icke - eller subneutralizing antikroppar som produceras under den primära infektionen har föreslagits som en potentiell allvarlig denguefeber som inträffade som sekundära infektionen. Det finns dock inga specifika antivirala läkemedel för DENV infektion5.
För utvecklingen av antivirala medel mot DENV är rutin och robusta analyser, som är mottagliga för en hög genomströmning inställning, avgörande för att upptäcka virusreplikation kvantitativt. Konventionellt, har biologiska analyser (t.ex., plack assay) för att kvantifiera smittsamma virus och immunologiska analyser (t.ex., enzymkopplad immunosorbentanalys [ELISA]) för att upptäcka virala antigener använts för att övervaka DENV replikering in vitro- och in-vivo6,7. Dessa analyser är dock ofta mödosamma och kräver flera dagar att utföra, vilket försvårar hanteringen av stora mängder prover. I detta avseende RT-qPCR är en tillförlitlig analys för att upptäcka DENV infektion: det är särskilda, känsliga och relativt snabb7. RT-qPCR tekniken har dessutom fler fördelar i en hög genomströmning format. Dock kräver det typiska förfarandet av RT-PCR RNA virus återvinning av viral nukleinsyra från insamlade prover. Även om olika extraktionsmetoder kan användas för RT-qPCR, behövs flera steg för att erhålla renat viral RNA. RT-qPCR analyser kräver också oftast dyra spin kolumner eller farliga organiska lösningsmedel, vilket gör förberedelseprocessen otympligare. Eftersom att undvika misskötsel eller korskontamination mellan prover är en kritisk faktor för framgångsrik kvantifiering av virala genomer, är en mindre mödosam och tidskrävande metod att föredra, särskilt om den RT-qPCR ska tillämpas på hög genomströmning format.
Vi rapporterar här, en enkel RT-qPCR-procedur för att mäta DENV RNA i en kultur supernatanten av infekterade celler som inte involverar viral RNA rening. Detta optimerade RT-qPCR-protokoll består av två steg: i) inkubering av en supernatant DENV-infekterad cell kultur med en bearbetning buffert, och ii) one-step RT-qPCR på en realtids PCR-instrumentet. DENV RNA i en kultur som supernatant kan därför upptäckas inom 90 min (figur 1). Vi beskriver också tillämpningen av den direkta RT-qPCR för andra RNA-virusinfektioner.
Protocol
1. beredning av mallen DNA RNA standard
- Förbereda ett PCR-mix (total volym på 50 μL, tabell 1) använder en plasmid DNA vektor som innehåller DENV-2 nya Guinea C (NGC, anslutningen nummer: AF038403.1) translaterade 3'-regionen (3' UTR)8 och primers (T7-DENV 3 'UTR Fwd och DENV 3' UTR Rvs) på 0,2 mL tub, som beskrivs i tabell 2.
Obs: Detta steg kommer att genomföras under en ren huv (eller i ett rent rum) att undvika kontaminering av någon amplikon-relaterade produkter. - PCR-Förstärk cDNA av T7 sekvens-smält DENV 3' UTR i en termocykler, med följande villkor: 30 cykler (98 ° c i 10 s, 55 ° C för 5 s, och 72 ° C för 5 s).
- Blanda PCR-reaktionen med 10 μL av 6 x gel-lastning färgämne och lasta den på en 1% agaros gel med en molekylär DNA-stege, från 0,1 till 10 kilobase par (kbp).
- Visualisera PCR-produkten (479 baspar [bp]) under lång våglängd UV-ljus med hjälp av en metod för visualisering av DNA och en gel som tänkbar system. Klipp ut DNA bandet med en ren skalpell.
- Extrahera DNA med hjälp av ett DNA-rening kit (Tabell för material).
Obs: Detta reningssteg kan utföras utanför ren huven, men det är viktigt att hålla en ren miljö under processen för att undvika RNase kontaminering, vilket är ett stort problem i följande DENV RNA standard syntesen steg.- Väga på gel-segmentet och tillsätt 100 μL av insamlingsbufferten per 100 mg gel segment i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Lös upp gelen genom inkubation vid 60 ° C i 5 – 15 min.
- Montera en DNA rening kolumn med en samling röret och överföra 600 μL av upplösta provet till kolumnen rening.
- Centrifugera vid 16 000 x g i 30 s och kassera genomflöde. Om provvolymen är större än 600 μL, applicera resten av provet till kolumnen för DNA-rening efter första spin och upprepa detta.
- Tillämpa 500 μL av tvätt buffert till kolumnen för DNA-rening.
- Centrifugera vid 16 000 x g under 30 s.
- Placera kolumnen till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tillsätt 50 μL av eluering buffert och inkubera kolumnen i rumstemperatur i 1 min.
- Centrifugera vid högsta hastighet för 1 min till eluera DNA.
- Mät den optiska densiteten av DNA på 260 nm på en spektrofotometer med 3 μL av eluerade provet. Använd samma volym av eluering buffert som en tom.
Obs: Mallen DNA kan förvaras vid-20 ° C fram till användning.
2. syntesen av RNA-standarden DENV 3' UTR
Obs: Upprätthålla ribonunkleas (RNase)-miljö så mycket som möjligt att utföra följande steg. Set-up av reagens bör utföras inuti en ren huva, använder nuclease-fri pipetter, tips och rör.
- Blanda in vitro- transkription (IVT) reaktion (med en total volym på 20 μL) med 100 ng T7 RNA arrangören sekvens-smält DENV 3' UTR DNA Template (från steg 1,6) i en 0,2 mL PCR-rör enligt beskrivningen i tabell 3.
- Inkubera vid 37 ° C i termocyklern för 2 h blandningen.
- Tillsätt 1 μL av DNAS till IVT reaktion och fortsätta inkubationen vid 37 ° C i 15 min.
- Rena den i vitro transkriberade RNA med en RNA rening kit (Tabell för material).
- Lägga till 80 μl RNase-fri H2O och 350 μL av insamlingsbufferten, inklusive 1% β-merkaptoetanol.
- Tillsätt 250 μL av 100% etanol till IVT reaktion och blanda väl genom pipettering.
- Montera en RNA rening kolumn med en samling röret och överföra det RNA-provet till kolumnen rening.
- Centrifugera det 8 000 x g för 15 s och kassera genomflöde.
- Applicera 500 μL av tvätt buffert till kolumnen RNA rening och centrifugera det 8000 x g i 2 min.
- Placera kolumnen i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tillsätt 50 μL av RNase-fri H2O och inkubera kolumnen i rumstemperatur i 1 min.
- Centrifugera det vid högsta hastighet för 1 min till eluera RNA.
- Mät den optiska densiteten av RNA på 260 nm på en spektrofotometer, använda 3 μL av eluerade provet. Använd samma volym av H2O som en tom.
- Bestämma antalet syntetiserade DENV 3' UTR RNA kopia. 1 ng DENV 3' UTR RNA (462 baser, figur 2) är jämförbar med 4,05 x 109 exemplar.
- Lagra RNA standarden vid-80 ° C fram till användning.
3. bearbetningen av Virus prover för RT-qPCR
Obs: Steg 3.1 – 3.3 skall utföras inuti biologiska säkerhetsdragskåp. I synnerhet måste hanteringen av kultur supernatanten innehållande ett infektiöst virus ske enligt biosäkerhet nivå 2 (eller högre) miljön.
- Blanda 199 μL av en bearbetning buffert och 1 μL av nuclease-fri proteinas K.
- Seriellt späd syntetiserade DENV 3' UTR RNA (från steg 2,6) 1:10 för att få 5 x 109 till 5 x 103 kopior/μL av RNA standard använder cell odlingsmedium (t.ex., DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum och antibiotika [DMEM/10% FBS]) som innehåller 40 enheter/mL RNase inhibitor.
- Blanda 5 μL av supernatanten kultur av DENV-infekterade celler och DENV 3' UTR RNA standard med 5 μL av bearbetning buffert/proteinas K lösning (från steg 3.1) med 8-tube PCR remsor eller en PCR-plattan med 96 brunnar. Som en icke-mall kontroll (NTC), blanda 5 μL av cellodlingsmedium (dvsinga virus ingår) med 5 μL av bearbetning buffert/proteinas K lösningen.
- Efter en kort centrifugering, inkubera proverna i en termocykler med följande villkor: 1 cykel (av 25 ° C i 10 min och 75 ° C i 5 min).
Obs: Bearbetade prover kan förvaras vid 4 ° C om realtids PCR analysen görs samma dag. För långsiktig lagring förvaras proverna vid-80 ° C.
4. realtids-PCR analys
Obs: Det rekommenderas starkt att utföra steg 4.1 – 4.4 inuti en ren huva att minimera kontaminering av amplikon-relaterade produkter eller RNase.
- Förbereda en RT-qPCR master mix med one-step RT-PCR reagens (Tabell för material) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör (RNase-fri) använder DENV 3' UTR-specifika primers och en fluorogenic sond (tabell 1). Skala upp volymen av varje komponent (tabell 4) enligt 11% mer av det totala antalet prover, inklusive standard RNA och NTC reaktionerna.
- Alikvotens 8 μl master mix i brunnen som ska användas i en 96 brunnar realtids PCR-plattan (Tabell för material).
- Kort Centrifugera de behandlade proverna, inklusive DENV 3' UTR RNA standard och NTC (från steg 3,4) och tillsätt 2 μl av proverna till varje brunn med 96 brunnar realtids PCR-plattan.
- Försegla PCR-plattan med optiskt klar självhäftande film.
- Kort Centrifugera plattan vid 200 x g ta bort luftbubblor.
- Placera plattan i en realtids PCR-instrumentet och cykel plattan med följande villkor: 1 cykel av RT stage (25 ° C i ca 10 min), 1 cykel av polymeras aktiveringen scenen 95 ° C i 2 min, 40 cykler av förstärkning scenen (95 ° C för 10 s och 60 ° C under 30 s [enskild datainsamling i detta steg]).
- Bestämma kopia antalet DENV RNA i prover med en realtids PCR-tillhörande programvara.
- Tilldela väl av en reaktion som ska analyseras som Okänt prov i fönstret Inställningar .
- Tilldela väl av seriellt utspädda DENV 3' UTR RNA som Standard och skriv antalet förväntade kopia av RNA standard i varje brunn (t.ex., om 5 x 103 kopior/μL RNA standardlösning används, Skriv 5.000). Tilldela brunnen som Negativkontroll för NTC.
- I fönstret analys Klicka på analysera och kontrollera att korrelationskoefficienten (R2) av standardkurvan genereras är lika eller större än 0,98.
- Generellt använder standardinställningarna för Ct (tröskel: auto, Originalstart cykel: auto, baslinjen slutet cykel: auto) för analys.
Obs: Kopiera antalet okända prov automatiskt beräknas baserat på cykel (Ct) tröskelvärdena i de individuella reaktionerna. Antalet beräknade kopia av varje prov är ansedd som RNA kopior per 10 μL RTqPCR reaktion (t.ex., om 12,345 anges i ett Okänt prov, detta innebär att 12.345 kopior av DENV RNA finns i reaktionen).
Representative Results
För kvantifiering av DENV RNA av RT-qPCR-analys, en standard av kända kopienumret, vilket kan upptäckas genom den samma primern, är en förutsättning. I detta protokoll, 462 nukleotid-långa RNA som innehåller den 3 'UTR sekvens av DENV-2 NGC stammen var i vitro transkriberas från T7 RNA arrangören-smält DENV-2 3' UTR DNA mall, som hade varit förökas med PCR och renat (figur 2A och 2B). När en seriell 10-faldig utspädning av standarden DENV RNA (från 5 x 109 till 5 x 102 kopior i en 10 μL RTqPCR reaktion) utsattes för en direkt RT-qPCR-analys med 3' UTR-specifika primers och en fluorogenic sond9, en linjär kurva med en bra korrelationskoefficient (R2 = 0.98726) erhölls (figur 2 c).
Därefter tillämpades denna direkta RT-qPCR-analys för att kvantifiera DENV i kultur supernatanten av virusinfekterade celler. DENV-2 (Singapore isolera EDEN2 329510), som hade spridits i C6/36 mygga celler och titreras med plack-analys med hjälp av BHK-21 celler11, var seriellt spädas (från 8 x 106 till 80 plack bildning enheter [PFU] / ml). DENV prover då behandlades med en lika stor volym bearbetning buffert innehållande proteinas K för att deproteinize virioner och utsätts för en direkt RT-qPCR-analys inriktning DENV 3' UTR RNA-sekvens. Igen, en bra korrelation (R2 = 0.99981) mellan DENV smittsamma titern och Ct, en cykel nummer som anses vara den punkt där den fluorescerande signalen stiger med exponentiell tillväxt över bakgrunden, erhölls (figur 3A). När Ct-värden som genereras från en seriell utspädning av DENV beståndet med kända smittsamma titrarna var plottas på standardkurvan med transkriberas in vitro- 3' UTR RNA, alla de tomter som erhållits från 8 x 106 till 80 PFU/mL (motsvarar 8 x 103 till 8 x 10-2 PFU i en 10 μL RTqPCR reaktion) var inom spänna av de utsätts för standard RNA (5 x 109 till 5 x 103 kopior i en 10 μL RTqPCR reaktion, figur 3B), vilket indikerar att DENV prover med ett brett utbud av smittsamma titrar kan analyseras på samma gång, med hjälp av denna direkta RT-qPCR. I parallella experiment undersöktes effekten av bearbetning buffert eller proteinas K behandling på påvisande av virus-RNA av RT-qPCR-analys. Även om behandling av en logg utspädning av DENV provet (8 x 106 till 8 x 102 PFU/mL) med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) ensam före RT-qPCR (1:1 utspädning av virus provet med PBS) och en inkubation av 25 ° C i 10 min och 75 ° C för 5 min framkallade en regressionskurvan (figur 3 c, svarta linjen), och de genomsnittliga Ct-värden som erhålls av PBS behandling var försenade 2.6 – 3,2 cykler jämfört med Ct erhålls genom bearbetning buffert/proteinas K behandling (figur 3 c, streckade linjen). Dessutom kunde den högsta utspädningen av virus (8 x 102 PFU/mL [8 x 10-1 PFU per 10 μL RTqPCR reaktion]) inte identifieras med denna PBS behandling (figur 3 c). I avsaknad av proteinas K under bearbetning buffert behandling (figur 3 c, grå linje) genererades en liknande regression; men förseningen i förstärkning (0,1 – 0,8 cykler) observerades fortfarande i förhållande till bearbetning reaktionen innehållande proteinas K (figur 3 c, streckade linjen). Dessa data indikerar att, bland de villkor som testats, behandling av DENV provet med bearbetning buffert tillsammans med proteinas K förbättrar känsligheten hos RT-qPCR-analys.
Den direkta RT-qPCR-analysen bedömdes vidare för dess tillämplighet på validering av antivirala medel mot DENV. Mykofenolsyra (MPA), en nonnucleoside hämmare av inosin-monofosfat dehydrogenas som används som ett immunsuppressivt medel vid transplantation, har rapporterats hämma DENV in vitro-12,13. Även om de tidigare studierna sysselsatt en konventionell plack assay eller ett flöde flödescytometri assay att upptäcka virala antigener för att demonstrera den hämmande effekten av MPA på DENV infektion12,13, i förevarande studie var direkt RT-qPCR tillämpas för att utvärdera den MPAS antiviral aktivitet. HeLa celler, som hade varit seedade på en densitet på 5 x 104 celler per brunn i en 24-well platta 1 dag före infektion, utsattes för DENV-2 på en MOI 1 för 1 h och, efter tvätt, odlade med DMEM/10% FBS i närvaro av 50 – 0,016 μg/mL () MPA (eller 0,1% dimetyl sulfoxid [DMSO]). Kultur supernatanten samlades in 3 dagar efter infektion och utsätts för direkt RTqPCR analysen använder DENV 3' UTR specifika primers och en fluorescerande sond. Figur 4 visar DENV RNA kopior (per reaktion) i cellkulturer av infekterade celler behandlas med ökande koncentrationer av MPA, som bestämdes av ett in vitro- transkriberas 3' UTR RNA standard. Med en behandling på 50 μg/mL (156 μM) MPA, observerades en minskning till 99.87 ± 0,02% av DMSO-behandlade kontroll kultur (figur 4). Ännu viktigare, IC50 (50% hämmande koncentration) värdet för MPA bestäms av de data som visas i figur 4 var 0,79 μM, som liknar värden som tidigare rapporterats12,13. Detta resultat, indikerar därför att denna direkta RT-qPCR-analys är en användbar och pålitlig metod för att bedöma den hämmande effekten av antivirala medel på DENV infektion.
Slutligen, tillämpningar av den direkta RT-qPCR-analysen till andra RNA-virus testades. När ett lager av gula febern-virus (YFV) 17D vaccinstammen (Flaviviridae), som hade varit förstärks i Vero-celler och titreras på BHK-21-celler, utsattes för direkt hjälp av RT-qPCR sond YFV-17 D-specifika primers och en fluorogenic14, som beskrivs i tabell 1, en standardkurva med bra direkt korrelation mellan virus titrar och Ct-värden genereras med en 10-faldig seriell utspädning av virus beståndet (3,2 x 105 3,2 PFU/ml, figur 5A). Jämväl, direkt RT-qPCR-analys av Chikungunya virus (CHIKV, Togaviridae) Ross stam materiel, som hade varit förstärks i Vero-celler och titreras på BHK-21-celler, med hjälp av CHIKV-specifika primers och en fluorogenic probe15 (tabell 1), gav en bra regression mellan infektiös titrar (4.4 x 108 till 4.4 x 103 PFU/mL) och Ct-värden (figur 5B). Detta var också fallet för detektion av en seriell utspädning (8 x 102 till 8 x 10-2 PFU/mL, figur 5 c) av mässlingvirus (MeV, Paramyxoviridae) som hade spridits och titreras med Vero-celler, med hjälp av tidigare rapporterade primers och en fluorogenic sond16 (tabell 1). Dessa data visar anpassningsförmåga hos direkt RT-qPCR-analys för kvantitativa detektion av olika RNA-virus.
Figur 1: arbetsflöde direkt RTqPCR analysens. Kultur supernatanten DENV-infekterade celler behandlas med en bearbetning buffert innehållande proteinas K för att släppa viral RNA (prov-bearbetning steg). Bearbetade provet är sedan blandas med one-step RT-PCR reagens och utsätts för realtids PCR analysen använder DENV 3' UTR-specifika primers och en fluorogenic sond. Nivåerna av viralt RNA upptäckt i respektive proven kan bestämmas genom en seriellt utspädda standard med hjälp av in vitro- transkriberas DENV RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: en standardkurva som genereras av DENV 3' UTR RNA. (A) Standard RNA som innehåller 3' UTR av DENV-2 NGC var transkriberas i vitro från en T7 RNA arrangören sekvens-smält PCR-fragment. (B) renat DENV 3' UTR RNA (250 ng) var visualiserat på en 1% agarosgel (högerfilen). Vänster körfält visar molekylvikt markören för RNA elektrofores. (C), en logg utspädning av DENV 3 'UTR RNA standard var behandlade med bearbetning buffert innehållande proteinas K och utsätts för en realtids PCR analys med hjälp av en one-step RT-qPCR reagens och DENV 3' UTR-specifika primers och en fluorogenic sond. De genomsnittliga Ct-värdena (n = 3) erhålls i respektive utspädningar var plottas mot den uppskattade kvantiteten för 3' UTR RNA (5 x 109 till 5 x 102 RNA kopior i en 10 μL RTqPCR reaktion). R2 är korrelationskoefficienten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kvantifiering av DENV RNA i virus lager av direkta RT-qPCR. (A), den hög-titer DENV-2 lager produceras i C6/36 celler var seriellt spädas 10-faldig (8 x 106 till 8 x 101 PFU/mL) med DMEM/10% FBS som innehåller en RNase inhibitor och utsätts för direkt RTqPCR analysen använder DENV 3' UTR-specifika primers /PROBE. (B), Ct-värdena som erhålls genom RT-qPCR av log-utspädd DENV lager (cirklar) var plottas på en standardkurva av 3' UTR RNA (trianglar) transkriberat in vitro-. Användning av 8 x 106 PFU/mL lager i en direkt RT-qPCR-analys motsvarar 8 x 103 PFU av virus i en 10 μL RTqPCR reaktion. (C), denna panel visar effekten av bearbetning buffert och proteinas K behandlingar på påvisande av virus-RNA. DENV utspädd lager (8 x 106 till 8 x 102 PFU/mL) var inkuberas med en lika stor volym bearbetning buffert innehållande proteinas K (vita cirklar), bearbeta buffert ensam (grå cirklar) eller PBS (svarta cirklar) och sedan utsätts för direkt RT-qPCR-analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: utvärdering av den hämmande effekten av MPA genom direkta RT-qPCR. HeLa celler var infekterade med DENV-2 på en MOI 1 och odlade i närvaro av ökande koncentrationer av MPA, en tidigare rapporterade hämmare av DENV (eller 0,1% DMSO). Tre dagar efter infektion, cellkulturer av de infektera cellerna samlades och utsätts för direkt RTqPCR analysen med DENV 3' UTR-specifika primers/sond. Kopia antalet viral RNA bestämdes av DENV 3' UTR RNA standard transkriberas in vitro. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: tillämpningen av direkta RT-qPCR för upptäckt av andra RNA virus. Seriellt utspädda viruslagren (A) YFV, (B) CHIKV och (C), MeV utsattes till den direkta RT-qPCR-analys med PCR primers och fluorogenic sonder specifika för deras respektive viral RNA-sekvenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Syfte | Namn | Sekvens (5' - 3') | Obs |
| T7 promotorn-smält DENV-2 3'UTR cDNA förstärkning | T7-DENV 3' UTR Fwd | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGc gaa tTA GAA GGC AAA ACT AAC ATG AAA | Kursiv, T7 promotorn; gemena, spacer; fet, DENV-2 NGC nukleotider 10.270-10,292 |
| DENV 3' UTR Rvs | AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC | DENV-2 NGC nukleotider 10,723-10,703 | |
| RT-qPCR-analys av DENV | DENV-2 3' UTR F | AAG GAC TAG AGG TTA GAG GAG ACC C | Referens 9 |
| DENV-2 3' UTR R | GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA TG | ||
| Sond 2 Den-2-4 | 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA AAG ACC-TAMRA | ||
| RT-qPCR-analys av YFV | YFV NS5 F | GAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT | Referens 14 |
| YFV NS5 R | GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G | ||
| YFV NS5 sond | 6FAM-CTA CGT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-TAMRA | ||
| RT-qPCR-analys av CHIKV | CHIK E1 F | TCG ACG CGC CCT CTT TAA | Referens 15 |
| CHIK E1 R | ATC-GAA TGC ACC GCA CAC T | ||
| CHIK E1 P | 6FAM-ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-TAMRA | ||
| RT-qPCR-analys av MeV | MeV N F | TGG KATT CTG AAC TCG GTA TCA C | Referens 16 |
| MeV N R | TGT CCT CAG TAG TAT GCA TTG CAA | ||
| MeV N P | 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA |
Tabell 1: Oligonukleotiden primer och fluorogenic probe sekvenser som används i denna studie.
| Komponenter | Beståndet koncentration | Volym (μl) | Slutlig koncentration |
| PrimeSTAR Max Premix | 2 x | 25 | 1 x |
| T7-DENV 3' UTR Fwd | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| DENV 3' UTR Rvs | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| pEU/DENV 3' UTR | 1 ng/μl | 1 | 20 pg/μL |
| Nuclease-fri H2O | 4 | ||
| Totalt | 50 |
Tabell 2: Blanda komponenter av en PCR för beredning av DENV 3' UTR templat-DNA.
| Komponenter | Beståndet koncentration | Volym (μl) | Slutlig koncentration |
| T7 sekvens-smält DENV 3' UTR DNA mall | (variabel) | x | 100 ng per reaktion |
| ATP lösning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| CTP lösning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| GTP lösning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| UTP lösning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| Reaktion buffert | 10 x | 2 | 1 x |
| T7 Enzym Mix | 2 | ||
| Rekombinant RNase Inhibitor | 40 enheter/μL | 1 | 2 enheter/μL |
| Nuclease-fri H2O | 7 - x | ||
| Totalt | 20 |
Tabell 3: Komponenter i en IVT blanda i syntetisera DENV 3' UTR RNA standarden.
| Komponenter | Beståndet koncentration | Volym (μl) | Slutlig koncentration i en RT-qPCR-reaktion |
| iTaq universal sonder reaktionsblandning | 2 x | 5,00 | 1 x |
| iScript avancerad omvänt transkriptas | 40 x | 0,25 | 100 ng per reaktion |
| Primer/sond mix | DENV-2 3' UTR F: 3 ΜM | 1,00 | 300 nM |
| DENV-2 3' UTR R: 3 ΜM | 300 nM | ||
| Sond 2 Den-2-4: 2 μM | 200 nM | ||
| Nuclease-fri H2O | 1,75 | ||
| Delsumma | 8,00 |
Tabell 4: komponenter i en master mix för RT-qPCR realtidsanalys av DENV RNA. Observera att 2 μL av bearbetade DENV prov (eller standard RNA) bör läggas till den 8-μL master mix (totalt 10 μL per reaktion).
Discussion
Idag, blir viral nukleinsyra upptäckt av lysrör-baserad realtids-PCR en guld-standard för molekylär diagnos av patogena mänskliga virus, på grund av dess känslighet och snabbhet7. Detta är särskilt viktigt för att bekräfta virusinfektion i den tidiga fasen av akuta infektionssjukdomar såsom denguefeber17. Också, i fältet DNEV grundforskning, RT-qPCR-analys är ett oumbärligt verktyg för övervakning av virusreplikation i in vitro- kultur, vilket kommer att leda till en förståelse för replikering biologi DENV och upptäckten av antivirala hämmare. I denna studie utvecklades lysrör-baserad realtids PCR analysen ytterligare av en kombination av en bearbetning buffert och en one-step RT-PCR reagens så att DENV RNA i kultur supernatanten av infekterade celler kunde kvantifieras av RT-qPCR utan rening viral RNA genomet. Jämfört med rutinmässiga analyser att upptäcka virus replikering, till exempel plack assay, ELISA eller konventionella RTqPCR anställa RNA rening6,7, ett förenklat protokoll hos RT-qPCR-analys resulterade i en stor minskning av tiden och stegen för att kvantifiera DENV RNA. Detta är också en viktig funktion som har fördelar i minimera kontaminering och förlust av genetiska material. Det bör dock noteras att användningen av en ren huva är viktigt i uppbyggnaden av IVT (steg 2.1) och RT-qPCR (steg 4.1 – 4.4) reaktioner på den korskontaminering av amplikon-relaterade produkter eller RNase. Det är också viktigt att hantera kulturen supernatanten, inklusive infektiösa virus, inuti en biosäkerhet skåp (steg 3.3) att minska en laboratorium infektionsrisk.
En annan betydelse av den direkta RT-qPCR-analysen är att ett brett utbud av viral RNA kopior kan analyseras på samma gång utan spädning eller koncentrationen i provet. När ett seriellt utspädda DENV 3' UTR RNA standard användes, direkt RTqPCR protokollet producerade en linjär standardkurva över sju storleksordningar, och den nedre gränsen för kvantifiering var 500 RNA kopior (figur 2). För detektion av DENV i kultur supernatanten av infekterade celler, 8 x 103 till 8 x 10-2 PFU virus i en 10 μL RTqPCR var inom spänna av DENV 3' UTR RNA standarden, och den nedersta detektionsgränsen (8 x 10-2 PFU) beräknades för att innehålla 11 , 400 ± 7,077 RNA kopior (figur 3B). Notera, som rapporterats i flera flavivirus studier18,19,20, observerades större förhållandet mellan viral RNA kopior till virus smittsam titer (dvs, PFU) i DENV prover också i denna studie. Denna överskattning antas vara till stor del på grund av defekt (dvs.icke-infektiös) virus eller gratis virus-RNA som är från infekterade och döda celler. Även om förhållandet mellan RNA kopior: PFU erhållit i denna studie (1.1 x 105 till 1,3 x 105 RNA kopior/PFU) var oförenligt med de data som visas tidigare (nyckeltal varierar från 1 till 3 log)21,20, detta kan vara hänföras till skillnaden i virusstammar, celler eller odlingsbetingelser som anställd. En annan sannolik förklaring till avvikelsen är att, eftersom inga RNA reningsprocess var inblandad i den direkta RT-qPCR-analys beskrivs häri, mer DENV RNA i kultur supernatanten kunde ha upptäckts av realtids PCR-analys utan förlust av viral genetiska material.
Enkelheten i den direkta RTqPCR förbättrar förmågan att hantera ett stort antal prover i flera format, till exempel en plattan med 96 brunnar. Därför hjälper detta boende den framtida tillämpningen av den direkta RT-qPCR-analysen till en high-throughput screening-studie för upptäckten av anti-DENV droger. Faktiskt, i detta betänkande, tillämpningen av den direkta RT-qPCR-analysen för validering av en anti-DENV hämmare, MPA, undersöktes och resultatet visade att en IC50 värdet av MPA som erhålls genom den direkta RT-qPCR-analysen (figur 4) var jämförbar med den rapporterats i tidigare studier med plack assay12,13. Detta visar att direkt RT-qPCR är en användbar analys för att på lämpligt sätt utvärdera den hämmande effekten av antivirala medel och kan antas till en drug screening studie i framtiden.
I denna studie gjordes försök att tillämpa den direkt RTqPCR detektering av andra RNA-virus. Som visas i figur 5, när 10-faldig utspädningar av tre andra RNA-virus (YFV CHIKV och MeV) delas in i olika släkten (Flaviviridae, Togaviridaeoch Paramyxoviridae, respektive) undersöktes med hjälp av tidigare sonder rapporterade primers och fluorogenic specifika för de respektiva viral RNA-sekvenserna. Bra korrelationer mellan infektiös titrar och Ct-värden erhölls genom direkta RTqPCR analyser och korrelationerna var 4-6 linjära storleksordningar. Detta tyder på att det direkta RT-qPCR-protokollet är anpassningsbar till olika typer av RNA-virus genom att helt enkelt ändra virus-specifika primers och fluorogenic sonder.
Känsligheten för upptäckt varierade dock bland de virus som testas i denna studie (figur 5). En ändring av protokollet som kan förbättra detektion av mål virus RNA bör vara att använda en ny uppsättning primer/sond sekvenser. Dessutom tros ett viktigt steg för den framgångsrika direkt RT-qPCR-analysen vara effektiv frigöraren av det virala genomet under provet bearbetningssteg (steg 3,1-3,4). Detta skulle vara av särskild betydelse för den kvantitativa detektion av stabila virus såsom en icke-höljebärande virus. Även om som ett förberedande experiment, Coxsackievirus B3 (CVB3), en icke-höljebärande RNA-virus som tillhör Picornaviridae, utsattes till den direkta RT-qPCR-analys med hjälp av tidigare beskrivna CVB3-specifika primers och fluorescerande sonden22, en positiv amplikon signal kunde inte detekteras även med en hög-titer (1 x 105 PFU/mL) virus lager. Detta anses till stor del kan tillskrivas icke-höljeförsedda viruset höga fysiska integritet. Hittills har vissa RT-PCR-analyser som inte kräver rening av nukleinsyra har utvecklats för att upptäcka flera RNA-virus, som sysselsätter olika protokoll i RNA release steg23,24,25, 26. således användning av alternativa (eller ytterligare) behandlingar, såsom en inkubation av ett virus prov vid hög temperatur, potentiellt ökar känsligheten för upptäckt.
Sammanfattningsvis var den direkta RT-qPCR-protokoll som utvecklats i denna studie en enkel och snabb men tillförlitlig metod för att kvantifiera viral RNA i en kultur supernatant av infekterade celler. På grund av denna enkelhet, kunde den direkta RT-qPCR-analysen behandla ett antal prover på kort tid, som innehar löfte för hög genomströmning analys av virusreplikation. Dessutom visades också tillämpningen av protokollet RTqPCR direkt på andra RNA-virus. Denna strategi bör därför vara ett användbart verktyg för att effektivt övervaka de RNA-virus infektionerna i laboratoriemiljö forskning och, eventuellt, i kliniska diagnoser.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Subhash G. Vasudevan (Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore) för den DENV-2 isolera EDEN2 3295 och Shunro Imura (Kobe Quarantine Station, Japan) för YFV 17D vaccinstammen. Författarna är också tacksam mot ledamöterna av Institutionen för mikrobiologi och vårdhygien för deras hjälp. Detta arbete stöds av MEXT KAKENHI Grant nummer JP16737900.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| 6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
| 2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
| Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
| illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
| CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
| Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | >600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
References
- Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).
- Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
- Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. How does Zika virus cause microcephaly? Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).
- Guzman, M. G., Harris, E. Dengue. Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).
- Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development. Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).
- Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. Tissue culture techniques for the study of dengue viruses. Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).
- Tang, K. F., Ooi, E. E.
- Suzuki, Y., et al. Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).
- Callahan, J. D., et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).
- Low, J. G., et al. Early Dengue infection and outcome study (EDEN) - study design and preliminary findings. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).
- Hishiki, T., et al. Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).
- Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology. 304 (2), 211-221 (2002).
- Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).
- Akondy, R. S., et al. Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).
- Edwards, C. J., et al. Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus. Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).
- Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).
- Peeling, R. W., et al.
- Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).
- Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. 4th Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).
- Wang, W. K., et al. Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).
- Gnadig, N. F., et al. Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).
- Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).
- Pastorino, B., et al. Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses. Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).
- Nishimura, N., et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).
- Kang, K., et al. A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification. Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).
