Summary
Analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale combinata con trascrizione inversa (RT-qPCR) è stato ampiamente utilizzato per misurare il livello di infezioni da virus a RNA. Qui presentiamo un'analisi di RT-qPCR diretta, che non richiede una fase di purificazione di RNA, sviluppato per la quantificazione di parecchi virus RNA, compreso il virus di febbre rompiossa.
Abstract
Attualmente, la tecnologia di reazione a catena (PCR) in tempo reale della polimerasi è uno strumento indispensabile per la rilevazione e la quantificazione di genomi virali nei laboratori di ricerca, così come per la diagnosi molecolare, a causa della sua sensibilità, specificità, e convenienza. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, l'analisi quantitativa di PCR (qPCR) generalmente utilizzato per rilevare l'infezione del virus ha fatto affidamento sulla purificazione dell'acido nucleico virale prima il passo PCR. In questo studio, l'analisi di fluorescenza-basata trascrizione inversa qPCR (RT-qPCR) si sviluppa attraverso la combinazione di un buffer di elaborazione e un reagente di One-step RT-PCR affinché l'intero processo, dalla raccolta del surnatante cultura di infettati da virus le cellule fino al rilevamento in tempo reale, può essere eseguita senza purificazione di RNA virale. Il protocollo stabilito consente la quantificazione di una concentrazioni di vasta gamma di RNA del virus dengue (DENV) all'interno di 90 min. Inoltre, l'adattabilità del dosaggio RT-qPCR diretto alla valutazione di un agente antivirale è dimostrata da un esperimento in vitro utilizzando un inibitore DENV precedentemente segnalato, l'acido micofenolico (MPA). Inoltre, altri virus RNA, inclusi virus della febbre gialla (YFV), virus di Chikungunya (CHIKV) e il virus del morbillo (MeV), può essere quantificata da RT-qPCR diretto con lo stesso protocollo. Pertanto, l'analisi di RT-qPCR diretto descritto in questo rapporto è utile per monitorare la replica del RNA del virus in modo rapido e semplice, che sarà ulteriormente sviluppato in una piattaforma promettente per uno studio di high throughput screening e la diagnosi clinica.
Introduction
Il genere Flavivirus della famiglia Flaviviridae comprende più di 70 avvolto, virus a RNA positivo filamento che vengono trasmessi da zanzare e zecche. D'importanza, infezione di flavivirus negli esseri umani spesso conduce alla malattia clinica severa, come febbre ed encefalite emorragica1. Infatti, una recente epidemia del virus di Zika (ZIKV), un flavivirus, esplosivo si è diffuso in tutta l'America ed è stata indicata per essere associata con le complicazioni neurologiche, compreso microcefalia2,3. Flavivirus, pertanto, avere significativo impatto clinico ed economico sulla società moderna.
Un flavivirus importante è virus dengue (DENV), un virus zanzara ampiamente distribuito nelle zone tropicali e subtropicali del mondo. DENV è trasmesso dalle zanzare Aedes , tra cui Aedes albopictus e Aedes aegypti, conseguente la diffusione globale di febbre rompiossa focolai4. Attualmente, l'organizzazione mondiale della sanità (OMS) classifica la malattia dengue come tre categorie: dengue senza segni premonitori, dengue con segni premonitori e grave febbre rompiossa4. Anche se l'infezione primaria con uno dei quattro sierotipi di DENV (DENV-1 a -4) è spesso asintomatica o auto-di limitazione, gli studi epidemiologici hanno dimostrato che l'infezione secondaria di sierotipi diversi aumenta il rischio di forme più gravi di febbre rompiossa. Vale la pena notare che anticorpo-dipendente il potenziamento di infezione DENV causata da non - o subneutralizing anticorpi prodotti durante l'infezione primaria è stata proposta come un meccanismo potenziale di dengue grave che si è verificato come l'infezione secondaria. Tuttavia, nessun farmaco antivirale specifico è disponibile per DENV infezione5.
Per lo sviluppo di agenti antivirali contro DENV, routine e robusti saggi, che sono favorevoli a un ambiente di alto-rendimento, sono essenziali per la rilevazione quantitativamente la replicazione del virus. Convenzionalmente, i saggi biologici (ad es., analisi della piastra) per la quantificazione di virus infettivi e saggi immunologici (ad es., analisi enzima-collegata dell'immunosorbente [ELISA]) per la rilevazione degli antigeni virali sono stati utilizzati per monitorare DENV replica in vitro e in vivo6,7. Tuttavia, queste analisi sono spesso laboriose e richiedono diversi giorni per compire, che ostacola la gestione di un gran numero di campioni. A questo proposito, RT-qPCR è un test affidabile per la rilevazione dell'infezione di DENV: è specifico, sensibile e relativamente veloce7. Inoltre, la tecnica di RT-qPCR ha più vantaggi in un formato ad alta velocità. Tuttavia, la procedura tipica di RT-PCR per il virus del RNA richiede il recupero di acidi nucleici virali da campioni raccolti. Anche se vari metodi di estrazione possono essere impiegate per RT-qPCR, più passaggi ancora sono necessari per ottenere RNA virale purificato. Inoltre, analisi di RT-qPCR di solito richiedono costosi filare colonne o pericolosi solventi organici, così da rendere il processo di preparazione più ingombrante. Poiché evitare manovre errate e/o cross-contaminazione tra i campioni è un fattore critico per il successo quantificazione dei genomi virali, un metodo meno laborioso e che richiede tempo è comodo, soprattutto se la RT-qPCR deve essere applicato a formato ad alta velocità.
Qui, segnaliamo una semplice procedura di RT-qPCR per misurare DENV RNA in un supernatante di coltura di cellule infette che non implichi la purificazione di RNA virale. Questo protocollo RT-qPCR ottimizzato è composto da due fasi: i) l'incubazione di un supernatante di coltura cellulare DENV-infettati con un buffer di elaborazione e ii) One-step RT-qPCR su uno strumento PCR in tempo reale. Di conseguenza, DENV RNA in un supernatante di coltura può essere rilevato all'interno di 90 min (Figura 1). Inoltre descriviamo l'applicazione della RT-qPCR diretti ad altre infezioni di virus a RNA.
Protocol
1. preparazione del modello del DNA del RNA Standard
- Preparare un PCR mix (volume totale di 50 μL, tabella 1) tramite un plasmide DNA vettore contenente DENV-2 Nuova Guinea C (NGC, numero di accessione: AF038403.1) 3' non tradotta regione (3' UTR)8 e primer (T7-DENV 3 'UTR Fwd e DENV 3' UTR Rvs) in una provetta da 0,2 mL, come descritto in tabella 2.
Nota: Questo passaggio deve essere effettuata sotto una cappa pulita (o in una camera pulita) per evitare la contaminazione di qualsiasi prodotti amplicon. - PCR-amplificare il cDNA di T7 sequenza-fuse DENV 3' UTR in un termociclatore, utilizzando le seguenti condizioni: 30 cicli (di 98 ° C per 10 s, 55 ° C per 5 s e 72 ° C per 5 s).
- Mescolare la reazione di PCR con 10 μL di 6 x colorante gel-carico e carico su un 1% di agarosio gel con una scala molecolare del DNA che variano da 0,1 a 10 paia di kilobase (kbp).
- Visualizzare il prodotto di PCR (479 paia di basi [bp]) sotto luce UV di lunghezza d'onda utilizzando un metodo di visualizzazione del DNA e un gel sistema di imaging. Tagliare la banda di DNA usando un bisturi pulito.
- Estrazione del DNA utilizzando un kit di purificazione di DNA (Tabella materiali).
Nota: Questo passaggio di purificazione può essere eseguito di fuori della cappa pulita, ma è essenziale per mantenere un ambiente pulito durante il processo per evitare la contaminazione di RNasi, che è un grande problema nei passaggi seguenti DENV RNA sintesi standard.- Pesare la fetta di gel e aggiungere 100 μL di buffer di acquisizione per 100 mg di gel fetta in una microcentrifuga da 1,5 mL.
- Sciogliere il gel mediante incubazione a 60 ° C per 5 – 15 min.
- Montare una colonna di purificazione del DNA con un tubo di raccolta e trasferire 600 μL del campione disciolto nella colonna di purificazione.
- Centrifugare a 16.000 x g per 30 s e scartare il flusso continuo. Se il volume del campione è maggiore di 600 μL, applicare il resto del campione alla colonna di purificazione del DNA dopo il primo giro e ripetere questo passaggio.
- Applicare 500 μL di tampone alla colonna di purificazione del DNA di lavaggio.
- Centrifuga a 16.000 x g per 30 s.
- Posizionare la colonna in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 50 μL di tampone di eluizione e incubare la colonna a temperatura ambiente per 1 min.
- Centrifugare a massima velocità per 1 minuto eluire il DNA.
- Misurare la densità ottica del DNA a 260 nm in uno spettrofotometro utilizzando 3 μL del campione eluito. Utilizzare lo stesso volume di tampone di eluizione come un vuoto.
Nota: Il modello di DNA possa essere memorizzato a-20 ° C fino all'utilizzo.
2. sintesi di DENV 3' UTR RNA Standard
Nota: Mantenere la ribonucleasi (RNasi)-ambiente libero per quanto possibile per eseguire la procedura seguente. Il set-up del reagente deve essere eseguito all'interno di una cappa pulita, utilizzando tubi, suggerimenti e pipette nucleasi-free.
- Mescolare in vitro trascrizione (IVT) reazione (di un volume totale di 20 μL) con 100 ng di RNA T7 promotore fusi con sequenza DENV 3' UTR mascherina del DNA (dal punto 1.6) in un tubo PCR 0,2 mL come descritto nella tabella 3.
- Incubare la miscela a 37 ° C in termociclatore per 2 h.
- Aggiungere 1 μL di DNasi per la reazione di IVT e continuare l'incubazione a 37 ° C per 15 min.
- Purificare il in vitro trascritto RNA usando un kit di purificazione di RNA (Tabella materiali).
- Aggiungere 80 µ l di RNAsi-libera H2O e 350 μL di buffer di acquisizione, tra cui 1% β-mercaptoetanolo.
- Aggiungere 250 µ l di etanolo al 100% per la reazione di IVT e mescolare bene di pipettaggio.
- Montare una colonna di purificazione di RNA con un tubo di raccolta e trasferire il campione di RNA nella colonna di purificazione.
- E centrifugare a 8.000 x g per 15 s e scartare il flusso continuo.
- Applicare 500 μL di tampone di lavaggio per la colonna di purificazione di RNA e centrifugare esso a 8.000 x g per 2 min.
- Posizionare la colonna in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 50 μL di RNAsi-libera H2O e incubare la colonna a temperatura ambiente per 1 min.
- Centrifugare e alla massima velocità per 1 minuto eluire il RNA.
- Misurare la densità ottica del RNA a 260 nm in uno spettrofotometro, utilizzando 3 μL del campione eluito. Utilizzare lo stesso volume di H2O come un vuoto.
- Determinare il numero di copie del DENV sintetizzato 3' UTR RNA. 1 ng di RNA DENV 3' UTR (462 basi, Figura 2) è paragonabile a 4,05 x 109 copie.
- Conservare lo standard di RNA a-80 ° C fino all'utilizzo.
3. trattamento dei campioni di Virus per RT-qPCR
Nota: Passaggi 3.1-3.3 devono essere eseguite all'interno di una cappa di sicurezza biologica. In particolare, gestione di supernatante di coltura contenente un virus infettivo dovrà essere effettuata nell'ambito dell'ambiente di livello 2 (o superiore) di biosicurezza.
- ΜL di mix 199 di un buffer di elaborazione e 1 μL di nucleasi-free proteinasi K.
- Diluire in serie il sintetizzato DENV 3' UTR RNA (dal punto 2.6) 01:10 ottenere 5 x 109 a 5 x 103 copie/μL di RNA utilizzando standard delle cellule di coltura (ad es., DMEM completati con 10% siero bovino fetale e antibiotici [DMEM/10% FBS]) contenente 40 unità/mL RNasi inibitore.
- Mix 5 μL del surnatante cultura di cellule infettate da DENV e lo DENV 3' UTR RNA standard con 5 μL di soluzione tampone/proteinasi K (dal punto 3.1) di elaborazione utilizzando strisce di PCR 8-tubo o una piastra PCR a 96 pozzetti. Come controllo non modello (NTC), mescolare 5 μL di terreno di coltura cellulare (vale a dire, nessun virus è incluso) con 5 μL della soluzione tampone/proteinasi K di elaborazione.
- Dopo una breve centrifugazione, incubare i campioni in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 1 ciclo (pari a 25 ° C per 10 min e 75 ° C per 5 min).
Nota: Campioni trattati possono essere mantenuti a 4 ° C se l'analisi PCR in tempo reale avviene lo stesso giorno. Per l'archiviazione a lungo termine, i campioni devono essere conservati a-80 ° C.
4. Real-Time PCR analisi
Nota: Si consiglia di eseguire passaggi 4.1 – 4.4 all'interno di una cappa pulita per ridurre al minimo la contaminazione di prodotti correlati amplicone o RNasi.
- Preparare un mix master RT-qPCR con reagente di un one-step RT-PCR (Tabella materiali) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL (RNAsi-libera) utilizzando DENV 3' UTR specifici primer e una sonda di fluorogenic (tabelle 1). Aumentare il volume di ogni componente (tabella 4) secondo 11% in più del numero totale di campioni, tra cui le reazioni di RNA e NTC standard.
- Aliquotare 8 μL di mix master nel bene per essere utilizzato in una piastra 96 pozzetti in tempo reale di PCR (Tabella materiali).
- Brevemente Centrifugare i campioni trattati, tra cui la DENV 3' UTR RNA standard e NTC (dal punto 3.4) e aggiungere 2 μL dei campioni in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti in tempo reale di PCR.
- Sigillare la piastra PCR con film adesivo otticamente trasparente.
- Centrifugare brevemente la piastra a 200 x g per rimuovere le bolle d'aria.
- Posizionare la piastra in uno strumento PCR in tempo reale e ciclo la piastra utilizzando le seguenti condizioni: 1 ciclo di RT tappa (25 ° C per 10 min), 1 ciclo della fase di attivazione della polimerasi (95 ° C per 2 min), 40 cicli di fase di amplificazione (95 ° C per 10 s e 60 ° C per 30 s [acquisizione dati singolo in questa fase]).
- Determinare il numero di copia del RNA DENV nei campioni utilizzando un software Real-Time PCR-collegata.
- Nella finestra di Setup , assegnare il pozzo di una reazione che deve essere analizzato come campione sconosciuto .
- Assegnare il pozzo del diluito serialmente DENV 3' UTR RNA come Standard e digitare il numero previsto di copia di RNA standard in ogni pozzetto (ad esempio, se vengono utilizzati 5 x 103 copie/μL di soluzione standard di RNA, digitare 5.000). Assegnare il pozzo come Controllo negativo per NTC.
- Nella finestra di analisi , fare clic su analizza e assicurarsi che il coefficiente di correlazione (R2) della curva standard generato è equivalente o maggiore di 0,98.
- In generale, utilizzare le impostazioni di default Ct (soglia: auto, ciclo di inizio previsto: auto, linea di base fine ciclo: auto) per l'analisi.
Nota: Il numero di copie dei campioni sconosciuti è automaticamente calcolato in base ai valori di soglia ciclo (Ct) delle reazioni individuali. Il numero calcolato copia di ciascun campione è considerato come copie di RNA per 10 reazione di RT-qPCR μL (ad es., se 12.345 è indicato in un campione sconosciuto , questo significa che sono presenti in 12.345 copie di RNA DENV la reazione).
Representative Results
Per la quantificazione del RNA DENV dall'analisi di RT-qPCR, standard del numero di copia nota, che può essere rilevato dall'iniettore stesso set, è un prerequisito. In questo protocollo, il RNA nucleotide-lungo 462 contenente il 3'UTR sequenza del ceppo NGC DENV-2 era in vitro trascritto dal RNA T7 promotore-fusi DENV-2 3' modello di DNA UTR, che era stato amplificato dalla PCR e purificato (Figura 2A e 2B). quando una diluizione seriale di 10 volte della norma DENV RNA (da 5 x 109 a 5 x 102 copie in una reazione di RT-qPCR 10 μL) è stato sottoposto ad un'analisi di RT-qPCR diretta utilizzando 3' UTR specifici primer e un fluorogenic sonda9, un lineare curva con un buon coefficiente di correlazione (R2 = 0.98726) è stato ottenuto (Figura 2).
Successivamente, questa analisi di RT-qPCR diretta è stata applicata per quantificare la DENV nel supernatante di coltura di cellule infettate da virus. DENV-2 (Singapore isolare 3295 EDEN210), che era stato propagato in cellule di zanzara C6/36 e titolato di saggio della placca con l'uso di cellule BHK-2111, è stata diluita in serie (da 8 x 106 a 80 placca formazione unità [PFU] / ml). DENV campioni sono stati poi trattati con un volume uguale di elaborazione tampone contenente proteinasi K per deproteinize virioni e sottoposti ad un'analisi di RT-qPCR diretta DENV 3' sequenza di RNA UTR di targeting. Ancora una volta, una buona correlazione (R2 = 0.99981) tra il titolo infettivo DENV ed il Ct, un numero di cicli che è considerato il punto dove il segnale fluorescente aumenta con la crescita esponenziale sopra lo sfondo, è stato ottenuto (Figura 3A). Quando generati da una diluizione seriale dello stock DENV con i titoli infettivi noti i valori di Ct sono stati tracciati sulla curva standard realizzata con in vitro trascritto 3' UTR RNA, tutte le trame ottenute da 8 x 106 a 80 PFU/mL (pari a 8 x 103 a 8 x 10-2 PFU in una reazione di RT-qPCR 10 μL) erano all'interno della gamma di quelli sottoposti ad RNA standard (5 x 109 a 5 x 103 copie in una reazione di RT-qPCR 10 μL, Figura 3B), che indica che DENV campioni con una vasta gamma di infettive i titoli possono essere analizzati allo stesso tempo, usando questo RT-qPCR diretto. In esperimenti paralleli, è stato studiato l'effetto di elaborazione buffer o trattamento di proteinasi K sulla rilevazione del RNA virale mediante l'analisi di RT-qPCR. Anche se il trattamento di una diluizione di registro del campione DENV (8 x 106 a 8 x 102 PFU/mL) con tampone fosfato salino (PBS) da solo prima del RT-qPCR (1:1 diluizione del campione virus con PBS) e un'incubazione di 25 ° C per 10 min e 75 ° C per 5 min ha suscitato un curva di regressione (Figura 3, linea nera) e i valori Ct medi ottenuti con il trattamento di PBS sono stati ritardati 2.6-3.2 cicli rispetto al Ct ottenuto dalla lavorazione di trattamento tampone/proteinasi K (Figura 3, linea tratteggiata). Inoltre, la più alta diluizione del virus (8 x 102 PFU/mL [8 x 10-1 PFU per reazione di RT-qPCR 10 μL]) poteva non essere rilevata con questo trattamento di PBS (Figura 3). In assenza di proteinasi K durante il trattamento di buffer di elaborazione (Figura 3, grigio linea), è stata generata una regressione simile; Tuttavia, il ritardo nell'amplificazione (cicli di 0,1 – 0,8) è stata ancora osservata rispetto la reazione di trasformazione contenente proteinasi K (Figura 3, linea tratteggiata). Questi dati indicano che, tra le condizioni testate, trattamento del campione DENV con buffer di elaborazione insieme con proteinasi K migliora la sensibilità del dosaggio RT-qPCR.
L'analisi di RT-qPCR diretto ulteriore è stata valutata per la sua applicabilità a convalidare gli agenti antivirali contro DENV. L'acido micofenolico (MPA), un inibitore di nonnucleoside dell'inosina monofosfato deidrogenasi che è usato come immunosoppressore nel trapianto, è stato riferito per inibire DENV in vitro12,13. Anche se gli studi precedenti impiegati un saggio della placca convenzionale o un'analisi di citometria a flusso per rilevare gli antigeni virali per dimostrare l'effetto inibitorio di MPA il DENV infezione12,13, nel presente studio, è stato diretto RT-qPCR applicata per valutare attività antivirale di MPA. Cellule HeLa, che erano state seminate ad una densità di 5 x 104 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti 1 giorno prima dell'infezione, sono stati esposti a DENV-2 a un MOI di 1 per 1 h e, dopo il lavaggio, coltivate con FBS DMEM/10% in presenza di 50 – 0,016 μg/mL MPA ( o 0,1% di dimetilsolfossido [DMSO]). Surnatante della cultura era raccolto 3 giorni dopo l'infezione e sottoposti a test RT-qPCR diretto utilizzando primers specifici per DENV 3' UTR ed una sonda fluorescente. La figura 4 Mostra le copie di RNA DENV (per reazione) nei surnatanti di coltura delle cellule infettate, trattati con aumento delle concentrazioni di MPA, che sono state determinate da un in vitro trascritto 3' standard UTR RNA. Con un trattamento di 50 μg/mL (156 μM) MPA, una riduzione a 99.87 ± 0.02% della cultura di controllo trattati con DMSO è stata osservata (Figura 4). Cosa importante, il valore di50 (concentrazione inibitoria 50%) di IC per MPA determinato dai dati illustrati nella Figura 4 era 0,79 μM, che è simile ai valori segnalati precedentemente12,13. Questo risultato, pertanto, indica che questa analisi di RT-qPCR diretta è un metodo utile ed affidabile per valutare l'effetto inibitorio degli agenti antivirali sull'infezione di DENV.
Infine, le applicazioni del test RT-qPCR diretto ad altri virus del RNA sono state testate. Quando uno stock di febbre gialla virus (YFV) 17D ceppo vaccinale (Flaviviridae), che era stato amplificato in cellule Vero e titolato su cellule BHK-21, è stato sottoposto a dirigere RT-qPCR utilizzando primer YFV 17D-specifici e un fluorogenic sonda14, come descritto nella tabella 1, potrebbe generare una curva standard con buona correlazione diretta tra i titoli del virus e valori Ct con una diluizione seriale 10 volte dello stock virus (3.2 x 105 a 3,2 PFU/mL, Figura 5A). Allo stesso modo, analisi di RT-qPCR del virus di Chikungunya (CHIKV, Togaviridae) diretta stock di ceppo di Ross, che era stato amplificato in cellule Vero e titolato su cellule BHK-21, utilizzando primer specifici CHIKV e un fluorogenic sonda15 (tabella 1), ha dato una buona regressione tra i titoli infettive (4.4 x 108 -4.4 x 103 PFU/mL) e i valori di Ct (figura 5B). Questo era anche il caso per la rilevazione di una diluizione seriale (8 x 102 a 8 x 10-2 PFU/mL, Figura 5) del virus del morbillo (MeV, Paramyxoviridae) che era stato propagato e titolato con cellule Vero, utilizzando in precedenza Primer segnalati e un fluorogenic sonda16 (tabella 1). Questi dati dimostrano l'adattabilità del dosaggio RT-qPCR diretto per la rilevazione quantitativa di vari virus del RNA.
Figura 1: flusso di lavoro del dosaggio diretto RT-qPCR. Il supernatante di coltura di cellule infettate da DENV è trattato con un buffer di elaborazione contenente proteinasi K per rilasciare il RNA virale (fase di trattamento del campione). Il campione preparato è poi mescolato con un reagente di One-step RT-PCR e sottoposti per l'analisi di PCR in tempo reale utilizzando DENV 3' UTR specifici primer e una sonda fluorogenic. I livelli di RNA virale rilevato nei rispettivi campioni possono essere determinati da una norma in serie diluita utilizzando in vitro trascritto RNA DENV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: una curva standard generata da DENV 3' UTR RNA. (A) Standard RNA contenenti 3' UTR di NGC DENV-2 è stato trascritto in vitro da un frammento di PCR fusi con sequenza del promotore di T7 RNA. (B) depurata DENV 3' UTR RNA (250 ng) è stata visualizzata su un gel di agarosio all'1% (corsia di destra). La corsia di sinistra mostra il marcatore di peso molecolare per elettroforesi del RNA. (C) A diluizione registro il primer DENV 3 'UTR RNA standard è stata trattata con il buffer di elaborazione contenente proteinasi K e sottoposto ad un'analisi PCR in tempo reale utilizzando un one-step RT-qPCR reagente e DENV 3' UTR-specifico e un set di sonde fluorogeniche. I valori medi di Ct (n = 3) ottenuti nelle rispettive diluizioni sono state tracciate contro la quantità stimata di 3' UTR RNA (5 x 109 a 5 x 102 RNA copia in una reazione di RT-qPCR 10 μL). R2 è il coefficiente di correlazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la quantificazione del RNA DENV in magazzino di virus da diretto RT-qPCR. (A), l'alto-titolo DENV-2 magazzino prodotta nelle cellule C6/36 in serie è stato diluito 10 volte (8 x 106 a 8 x 101 PFU/mL) con FBS DMEM/10% contenente un inibitore di RNAsi e sottoposti a test RT-qPCR diretto utilizzando DENV 3' UTR specifici primers /Probe. (B) Ct i valori ottenuti da RT-qPCR di stock DENV registro-diluito (cerchi) sono stati tracciati su una curva standard del 3' UTR RNA (triangoli) trascritta in vitro. L'uso di 8 x 106 PFU/mL di brodo in un'analisi di RT-qPCR diretta corrisponde a 8 x 103 PFU del virus in un 10 μL di reazione di RT-qPCR. (C), questo pannello mostra l'effetto di elaborazione buffer e trattamenti di proteinasi K sulla rilevazione del RNA virale. Stock DENV diluito (8 x 106 a 8 x 102 PFU/mL) è stato incubato con un volume uguale di elaborazione tampone contenente proteinasi K (cerchi bianchi), elaborazione da solo (cerchi grigi) buffer o PBS (cerchi neri) e poi sottoposto al diretto Analisi di RT-qPCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: valutazione dell'effetto inibitorio del MPA di diretto RT-qPCR. Cellule HeLa sono state infettate con DENV-2 a un MOI di 1 e coltivate in presenza di concentrazioni crescenti del MPA, un inibitore precedentemente segnalato di DENV (o 0.1% DMSO). Tre giorni dopo l'infezione, surnatanti delle cellule infette sono stati raccolti e sottoposti a test RT-qPCR diretto usando DENV 3' UTR specifici primer/sonda. Il numero di copie di RNA virale è stato determinato DENV 3' UTR RNA trascritto standard in vitro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: l'applicazione di RT-qPCR diretto per la rilevazione di altri virus RNA. Virus in serie diluito scorte di YFV (A), (B) CHIKV e (C) MeV sono stati sottoposti per l'analisi di RT-qPCR diretto utilizzando iniettori di PCR e fluorogenic sonde specifiche per le loro rispettive sequenze di RNA virale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Scopo | Nome | Sequenza (5' - 3') | Nota |
| Fusi promotore T7 DENV-2 3' amplificazione del cDNA UTR | T7-DENV 3' UTR Fwd | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGgaa c tTA GAA GGC Airoldi ACT AAC ATG | Corsivo, promotore T7; minuscolo, distanziale; grassetto, NGC DENV-2 nucleotidi 10.270-10.292 |
| DENV 3' UTR Rvs | AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC | Nucleotidi DENV-2 NGC 10.723-10.703 | |
| Analisi di RT-qPCR di DENV | DENV-2 3' UTR F | AAG GAC AGG TAG TTA GAG GAG ACC C | Riferimento 9 |
| DENV-2 3' UTR R | GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA TG | ||
| Sonda 2 Den-2-4 | 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA AAG ACC-TAMRA | ||
| Analisi di RT-qPCR di YFV | YFV NS5 F | GAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT | Riferimento 14 |
| YFV NS5 R | GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G | ||
| YFV NS5 sonda | 6FAM-CTA CGT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-TAMRA | ||
| Analisi di RT-qPCR di CHIKV | CHIK E1 F | TCG ACG CGC CCT CTT TAA | Riferimento 15 |
| CHIK E1 R | ATC GAA TGC ACC GCA CAC T | ||
| CHIK E1 P | 6FAM-ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-TAMRA | ||
| Analisi di RT-qPCR MeV | MeV N F | TGG GATTO CTG AAC TCG GTA TCA C | Riferimento 16 |
| MeV N R | TGT CCT CAG TAG TAT GCA TTG CAA | ||
| MeV N P | 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA |
Tabella 1: Oligonucleotide primer e fluorogenic sonda sequenze utilizzate in questo studio.
| Componenti | Concentrazione d'archivio | Volume (µ l) | Concentrazione finale |
| Premix PrimeSTAR Max | 2 x | 25 | 1 x |
| T7-DENV 3' UTR Fwd | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| DENV 3' UTR Rvs | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| pEU/DENV 3' UTR | 1 ng/μL | 1 | 20 pg/μL |
| H2O Nuclease-free | 4 | ||
| Totale | 50 |
Tabella 2: Componenti di una PCR mix per la preparazione di DENV 3' UTR di DNA.
| Componenti | Concentrazione d'archivio | Volume (µ l) | Concentrazione finale |
| T7 fusi con sequenza DENV 3' UTR mascherina del DNA | (variabile) | x | 100 ng per reazione |
| Soluzione di ATP | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| Soluzione CTP | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| Soluzione di GTP | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| Soluzione UTP | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| Tampone di reazione | 10 x | 2 | 1 x |
| T7 Mix di enzima | 2 | ||
| Inibitore ricombinante RNasi | 40 unità/μL | 1 | 2 unità/μL |
| H2O Nuclease-free | 7 - x | ||
| Totale | 20 |
Tabella 3: Componenti di un IVT si mescolano per sintetizzare lo standard DENV 3' UTR RNA.
| Componenti | Concentrazione d'archivio | Volume (µ l) | Concentrazione finale in una reazione di RT-qPCR |
| iTaq universale sonde mix di reazione | 2 x | 5,00 | 1 x |
| iScript avanzata della trascrittasi inversa | 40 x | 0.25 | 100 ng per reazione |
| Mix di primer/sonde | DENV-2 3' UTR F: 3 ΜM | 1.00 | 300 nM |
| DENV-2 3' UTR R: 3 ΜM | 300 nM | ||
| Sonda 2 Den-2-4: 2 μM | 200 nM | ||
| H2O Nuclease-free | 1.75 | ||
| Totale parziale | ore 8.00 |
Tabella 4: componenti di un mix master per Real-Time RT-qPCR analisi di RNA DENV. Si noti che 2 μL del campione preparato DENV (o RNA standard) deve essere aggiunto al mix master 8 μL (un totale di 10 μL per reazione).
Discussion
Oggi, la rilevazione dell'acido nucleico virale mediante PCR in tempo reale basati su fluorescente sta diventando un gold standard per la diagnosi molecolare di virus patogeni umani, a causa della sua sensibilità e rapidità7. Ciò è particolarmente importante per la conferma di infezione da virus nella fase precoce di malattie infettive acute come febbre di febbre rompiossa17. Inoltre, nel campo della ricerca di base DNEV, analisi di RT-qPCR è uno strumento indispensabile per la replicazione del virus in cultura, in vitro , che condurrà ad una comprensione della biologia replica di DENV e la scoperta degli inibitori antivirali di monitoraggio. In questo studio, l'analisi di PCR in tempo reale basati su fluorescente più ulteriormente è stato sviluppato da una combinazione di un buffer di elaborazione e un reagente di One-step RT-PCR affinché DENV RNA nel supernatante di coltura delle cellule infettate è stato in grado di essere quantificata per RT-qPCR senza purificazione il genoma virale del RNA. Rispetto alle analisi di routine per rilevare la replicazione del virus, come saggio della placca, ELISA o convenzionale RT-qPCR impiegando RNA purificazione6,7, un protocollo semplificato del dosaggio RT-qPCR ha provocato una notevole riduzione del tempo e passaggi necessari per quantificare il RNA DENV. Questo è anche una caratteristica importante che ha dei vantaggi riducendo al minimo la contaminazione e la perdita di materiale genetico. Tuttavia, si deve osservare che l'uso di una cappa pulita è essenziale nella messa a punto di IVT (punto 2.1) e reazioni di RT-qPCR (passaggi 4.1 – 4.4) per evitare la contaminazione di prodotti correlati amplicone o RNasi. È anche fondamentale per gestire il surnatante, compresi virus contagioso, all'interno di una cappa di biosicurezza (punto 3.3) per ridurre il rischio di infezione da laboratorio di cultura.
Un altro significato del dosaggio RT-qPCR diretto è che una vasta gamma di copie di RNA virale possa essere analizzata allo stesso tempo senza diluizione o concentrazione del campione. Quando è stato utilizzato diluito serialmente DENV 3' UTR RNA standard, il protocollo RT-qPCR diretto prodotto una curva lineare standard sopra sette ordini di grandezza e il limite di quantificazione inferiore era 500 copie di RNA (Figura 2). Per la rilevazione di DENV nel supernatante di coltura delle cellule infettate, 8 x 103 a 8 x 10-2 virus PFU in un 10 μL RT-qPCR erano entro lo standard gamma di DENV 3' UTR RNA ed il limite inferiore di rilevamento (8 x 10-2 PFU) è stato calcolato per contenere 11 , 400 ± 7.077 copie di RNA (Figura 3B). Di nota, come riportato in diversi flavivirus studi18,19,20, il più grande rapporto di copie di RNA virale a titolo infettive del virus (cioè, PFU) in campioni di DENV inoltre è stato osservato in questo studio. Questa sopravvalutazione è presupposto per essere in gran parte dovuto la presenza di difettoso (cioè, non-infettiva) virus o il RNA virale libero liberati dalle cellule infette e morte. Anche se il rapporto di RNA copie: PFU ottenuti in questo studio (1.1 x 105 a 1,3 x 105 RNA copie/PFU) era in contrasto con i dati riportati in precedenza (gamma di rapporti da 1 a 3 log)21,20, questo può essere attribuito per la differenza di ceppi di virus, cellule o condizioni di coltura impiegate. Un'altra spiegazione probabile per la discrepanza è che, dal momento che nessun processo di purificazione di RNA è stato coinvolto nell'analisi della RT-qPCR diretto qui descritto, più DENV RNA nel surnatante cultura potrebbe essere rilevata dall'analisi di PCR in tempo reale senza la perdita di virale materiali genetici.
La semplicità del diretto RT-qPCR aumenta la capacità di gestire un elevato numero di campioni in multi-ben formati, ad esempio una piastra a 96 pozzetti. Pertanto, questa proprietà vi assisterà la futura applicazione del test RT-qPCR diretto ad uno studio di screening ad alta resa per la scoperta di farmaci anti-DENV. Infatti, in questo rapporto, applicazione del test RT-qPCR diretto per la convalida di un inibitore anti-DENV, MPA, è stato esaminato, e il risultato ha mostrato che un valore di50 IC di MPA ottenuto dall'analisi di RT-qPCR diretto (Figura 4) era paragonabile a quella riferito negli studi precedenti usando placca dosaggio12,13. Questo dimostra che RT-qPCR diretto è un test utile per valutare in modo appropriato l'effetto inibitorio degli agenti antivirali e può essere adottata in una droga Studio di screening in futuro.
In questo studio, sono stati tentativi di applicare la RT-qPCR diretto per la rilevazione di altri virus RNA. Come mostrato nella Figura 5, quando 10 volte diluizioni di tre altri virus RNA (YFV, CHIKV e MeV) classificate in generi diversi (Flaviviridae, Togaviridaee Paramyxoviridae, rispettivamente) sono stati esaminati usando precedentemente segnalati primer e fluorogenic sonde specifiche per le rispettive sequenze RNA virali. Buone correlazioni tra infettivi titoli e valori di Ct sono state ottenute dall'analisi di RT-qPCR dirette e le correlazioni erano lineari 4-6 ordini di grandezza. Questo suggerisce che il protocollo RT-qPCR diretto è adattabile a vari tipi di virus del RNA semplicemente cambiando i virus-specifici primer e sonde fluorogeniche.
Tuttavia, la sensibilità di rilevamento varia fra i virus testati in questo studio (Figura 5). Una modifica del protocollo che può migliorare la rilevazione del RNA del virus di destinazione dovrebbe essere quello di utilizzare un nuovo set di sequenze primer/sonda. Inoltre, un passo fondamentale per il successo diretto RT-qPCR dosaggio è pensato per essere il rilascio efficiente del genoma virale durante l'esempio elaborazione di passo (passaggi 3.1-3.4). Questo sarebbe di particolare importanza per la rilevazione quantitativa di virus stabile come un virus non capsulati. Anche se come un esperimento preliminare, Coxsackievirus B3 (CVB3), un virus a RNA non capsulati appartenendo a Picornaviridae, è stato sottoposto a test RT-qPCR diretto utilizzando primer CVB3 specifici descritti in precedenza e sonda fluorescente22, un amplicon positivo segnale potrebbe non essere rilevato anche con uno stock di virus di alto-titolo (1 x 105 PFU/mL). Questo è considerato essere in gran parte attribuita all'alta integrità fisica del virus non capsulati. Finora, alcune analisi di RT-PCR che non richiedono la purificazione dell'acido nucleico sono state sviluppate per rilevare diversi virus del RNA, che impiegano protocolli diversi nella versione RNA passo23,24,25, 26. così, l'uso dei trattamenti alternativi (o supplementari), ad esempio un'incubazione di un campione di virus ad alta temperatura, potenzialmente aumenta la sensibilità di rilevazione.
In sintesi, il protocollo RT-qPCR diretto sviluppato in questo studio era un metodo semplice e rapido ma affidabile per la quantificazione di RNA virale in un supernatante di coltura delle cellule infettate. L'analisi di RT-qPCR diretto, a causa di questa semplicità, è in grado di elaborare un numero di campioni in tempi brevi, che tiene la promessa per l'analisi ad alta velocità di replicazione del virus. Inoltre, l'applicazione del protocollo RT-qPCR diretto ad altri virus RNA inoltre è stata dimostrata. Questo approccio dovrebbe, pertanto, essere uno strumento utile per il monitoraggio in modo efficiente le infezioni di virus a RNA in un ambiente di laboratorio di ricerca e, possibilmente, in diagnosi cliniche.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Subhash G. Vasudevan (Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore) per DENV-2 isolare EDEN2 3295 e Shunro Imura (Kobe Quarantine Station, Giappone) per il YFV sforzo vaccine 17D. Gli autori sono anche grati ai membri del dipartimento di microbiologia e controllo delle infezioni per la loro assistenza. Questo lavoro è supportato da MEXT KAKENHI Grant numero JP16737900.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| 6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
| 2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
| Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
| illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
| CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
| Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | >600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
References
- Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).
- Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
- Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. How does Zika virus cause microcephaly? Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).
- Guzman, M. G., Harris, E. Dengue. Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).
- Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development. Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).
- Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. Tissue culture techniques for the study of dengue viruses. Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).
- Tang, K. F., Ooi, E. E.
- Suzuki, Y., et al. Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).
- Callahan, J. D., et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).
- Low, J. G., et al. Early Dengue infection and outcome study (EDEN) - study design and preliminary findings. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).
- Hishiki, T., et al. Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).
- Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology. 304 (2), 211-221 (2002).
- Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).
- Akondy, R. S., et al. Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).
- Edwards, C. J., et al. Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus. Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).
- Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).
- Peeling, R. W., et al.
- Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).
- Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. 4th Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).
- Wang, W. K., et al. Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).
- Gnadig, N. F., et al. Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).
- Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).
- Pastorino, B., et al. Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses. Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).
- Nishimura, N., et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).
- Kang, K., et al. A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification. Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).
