Summary
Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie analyse gecombineerd met omgekeerde transcriptie (RT-qPCR) is wijd verbeid gebruikt voor het meten van het niveau van de RNA-virusinfecties. Hier presenteren we een directe RT-qPCR assay, die niet een RNA-zuivering hoeft, ontwikkeld voor de kwantificering van verschillende RNA virussen, met inbegrip van dengue virus.
Abstract
Op dit moment real-time polymerase kettingreactie (PCR) technologie is een onmisbaar hulpmiddel voor de detectie en kwantificering van het virale genoom in onderzoekslaboratoria, alsmede voor moleculaire diagnostiek, vanwege de gevoeligheid, specificiteit, en gemak. Echter in de meeste gevallen de kwantitatieve bepaling van de PCR (qPCR) in het algemeen gebruikt voor speurder virusinfectie heeft vertrouwd op de zuivering van virale nucleïnezuur voorafgaand aan de PCR-stap. In deze studie, is de omgekeerde transcriptie fluorescentie gebaseerde qPCR (RT-qPCR) test ontwikkeld door de combinatie van een verwerking buffer en een one-step RT-PCR reagens zodat het hele proces, van de oogst van het supernatans dat cultuur van virus-geïnfecteerde cellen tot real-time detectie, kunnen worden uitgevoerd zonder virale RNA zuivering. De gangbaar protocol kan de kwantificering van een breed scala van RNA concentraties van dengue virus (DENV) binnen 90 min. Daarnaast is het aanpassingsvermogen van de directe bepaling van de RT-qPCR aan de evaluatie van een antivirale agent aangetoond door een in vitro -experiment met behulp van een eerder gemelde DENV-remmer, mycophenolic zuur (MPA). Andere RNA-virussen, inclusief gele koorts virus (YFV), Chikungunya-virus (CHIKV) en mazelenvirus (MeV), kunnen bovendien worden gekwantificeerd door directe RT-qPCR met hetzelfde protocol. Dus, de directe RT-qPCR bepaling in dit verslag beschreven is handig voor het controleren van de replicatie van RNA-virus op een eenvoudige en snelle wijze, die verder zal worden ontwikkeld tot een veelbelovende platform voor high-throughput screening onderzoek en klinische diagnose.
Introduction
Het geslacht Flavivirus van de Flavivirus -familie omvat meer dan 70 gehuld, positief-stranded RNA-virussen die worden overgebracht door muggen en teken. Bovenal leidt flavivirus infectie bij de mens vaak tot ernstige klinische ziekte, zoals hemorragische koorts en encefalitis1. Inderdaad, een recente uitbraak van het Zika-virus (ZIKV), een flavivirus, explosief heeft verspreid over Amerika en is aangetoond dat gepaard gaan met neurologische complicaties, met inbegrip van microcefalie2,3. Flavivirussen, daarom hebben significante klinische en economische invloed op de moderne samenleving.
Een belangrijke flavivirus is dengue virus (DENV), een muggen overgebrachte virus verspreid in de tropische en subtropische gebieden van de wereld. DENV wordt overgedragen door Aedes -muggen, met inbegrip van Aedes albopictus en Aedes aegypti, resulterend in de wereldwijde verspreiding van dengue uitbraken4. Op dit moment de World Health Organization (WHO) dengue ziekte classificeert als drie categorieën: dengue zonder waarschuwingsborden, dengue met waarschuwingsborden en ernstige dengue4. Hoewel de primaire infectie met één van de vier serotypes van DENV (DENV-1-4) is vaak asymptomatisch of zelfbeperkende, hebben epidemiologische studies aangetoond dat de secundaire infectie van verschillende serotypes het risico van meer ernstige vormen van dengue verhoogt. Het is vermeldenswaard dat antilichaam-afhankelijke versterking van DENV infectie veroorzaakt door het niet - of subneutralizing van antilichamen geproduceerd tijdens de primaire infectie is voorgesteld als een potentiële mechanisme van ernstige dengue die zich hebben voorgedaan als het secundaire infectie. Echter is geen specifieke antivirale drug beschikbaar voor DENV infectie5.
Voor de ontwikkeling van antivirale middelen tegen DENV zijn routine en robuuste vitrotests, die zich lenen voor een high-throughput instelling, van essentieel belang voor het opsporen van virus replicatie kwantitatief. Conventioneel, zijn biologische testen (bijvoorbeeld, plaque assay) voor het kwantificeren van besmettelijke virussen en immunologische testen (bijvoorbeeld, enzym-verbonden immunosorbent analyse [ELISA]) voor het opsporen van virale antigenen gebruikt voor het controleren van DENV replicatie in vitro en in vivo6,7. Echter deze testen vaak moeizame en vereisen meerdere dagen te bereiken, die de behandeling van grote aantallen monsters die monsters belemmert. In dit verband RT-qPCR is een betrouwbare assay voor het opsporen van DENV-infectie: het is specifieke, gevoelige en relatief snelle7. Daarnaast heeft de RT-qPCR techniek meer voordelen in een high-throughput formaat. Niettemin, de typische procedure van rechts-PCR voor RNA virussen vraagt de terugwinning van virale nucleic zuren uit verzamelde monsters. Hoewel verschillende extractiemethoden kunnen worden ingezet voor RT-qPCR, zijn nog steeds meerdere stappen nodig te verkrijgen van gezuiverde virale RNA. RT-qPCR testen vereisen ook, meestal dure spin kolommen of gevaarlijke organische oplosmiddelen, waardoor het voorbereidingsproces omslachtiger. Aangezien het vermijden van verkeerde behandeling en/of kruisbesmetting tussen de monsters een kritische factor voor de succesvolle kwantificering van het virale genoom is, heeft een minder moeizame en tijdrovende methode de voorkeur, met name als de RT-qPCR moet worden toegepast op High-throughput formaat.
Wij rapporteren hier een eenvoudige procedure van de RT-qPCR voor het meten van DENV RNA in een cultuur supernatant van geïnfecteerde cellen die geen virale RNA zuivering. Dit geoptimaliseerde RT-qPCR-protocol bestaat uit twee stappen: i) de incubatie van een supernatant van cultuur van de cel DENV-besmet met een buffer van de verwerking, en ii) one-step RT-qPCR op een real-time PCR-instrument. Dienovereenkomstig, DENV RNA in een cultuur supernatant kan worden gedetecteerd binnen 90 min (Figuur 1). Ook beschrijven we de toepassing van de directe RT-qPCR op andere RNA-virus-infecties.
Protocol
1. voorbereiding van de sjabloon van het DNA van RNA standaard
- Bereiden een PCR mix (totaalvolume van 50 μl, tabel 1) met behulp van een plasmide DNA vector bevattende DENV-2 Nieuw-Guinea C (NGC, toetreding nummer: AF038403.1) 3' onvertaald region (3' UTR)8 - en grondlagen (T7-DENV-3 'UTR Fwd en DENV-3' UTR Rvs) in een 0,2 mL-buis, als beschreven in tabel 2.
Opmerking: Deze stap is om te worden uitgevoerd onder een schone motorkap (of in een cleanroom) om te voorkomen dat de besmetting van alle amplicon-gerelateerde producten. - PCR-versterken de cDNA van T7 sequentie-gesmolten DENV 3' UTR in een thermocycler, met behulp van de volgende voorwaarden: 30 cycli (van 98 ° C gedurende 10 s, 55 ° C gedurende 5 s, en 72 ° C gedurende 5 s).
- Meng de PCR-reactie met 10 μL van 6 x gel-laden kleurstof en laden het op een 1% agarose gel met een moleculaire ladder van DNA, variërend van 0.1 tot 10 kilobase paren (kbp).
- Visualiseer het PCR-product (479 basenparen [bp]) onder lange golflengte UV-licht met behulp van de methode van een DNA-visualisatie en een gel imaging systeem. Knip de band van de DNA met behulp van een schone scalpel.
- Uittreksel DNA met behulp van een DNA zuivering kit (Tabel van materialen).
Opmerking: Deze zuivering kan worden uitgevoerd buiten de schone kap, maar het is essentieel om te houden van een schoon milieu tijdens het proces om RNase verontreiniging, dat een groot probleem in de volgende DENV RNA standaard synthese stappen is te voorkomen.- Wegen van het gel-segment en voeg 100 μl van opnamebuffer per 100 mg gel segment in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
- De gel los door incubatie bij 60 ° C gedurende 5-15 minuten.
- Een kolom zuivering DNA met een collectie buis monteren en 600 μL van de opgeloste monster overbrengen in de kolom zuivering.
- Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 30 s en negeren de doorstroming. Als het monstervolume groter dan 600 μL is, de rest van het monster van toepassing op de DNA zuivering kolom na de eerste spin en herhaal deze stap.
- Toepassing 500 μL buffer naar de DNA zuivering kolom te wassen.
- Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 30 s.
- Plaats de kolom in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Voeg 50 l elutie buffer en de kolom bij kamertemperatuur voor 1 min uit te broeden.
- Centrifugeer bij de maximale snelheid voor 1 min te elueren DNA.
- Meet de optische dichtheid van DNA bij 260 nm in een spectrofotometer met 3 μl van het eluted monster. Gebruik dezelfde hoeveelheid elutie buffer als een leeg.
Opmerking: De DNA-sjabloon kan worden achtergelaten bij-20 ° C tot gebruik.
2. Samenvatting van de DENV 3' UTR RNA standaard
Opmerking: Handhaven de ribonuclease (RNase)-vrije omgeving zo veel mogelijk de volgende stappen uit te voeren. De opzet van het reagens moet worden uitgevoerd binnen een schone kap, met behulp van de nuclease-vrije pipets, tips en buizen.
- Meng de in vitro transcriptie (IVT) reactie (van een totaal volume van 20 μL) met 100 ng voor T7 RNA promotor sequentie-gesmolten DENV 3' UTR DNA template (uit stap 1.6) in een buis van 0,2 mL PCR, zoals beschreven in tabel 3.
- Incubeer het mengsel bij 37 ° C in de thermocycler gedurende 2 uur.
- Voeg 1 μL van DNase naar de reactie van IVT en blijven de incubatie bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Zuiveren de in vitro Getranscribeerd RNA met behulp van een RNA zuivering kit (Tabel van materialen).
- Voeg 80 μL van RNase-vrije H2O en 350 μL van de opnamebuffer in beslag, waaronder 1% β-mercaptoethanol.
- 250 μL van 100% ethanol toevoegen aan de reactie van IVT en meng het goed door pipetteren.
- Monteren van een RNA zuivering kolom met een collectie buis en overbrengen van het RNA-monster naar de zuivering kolom.
- Centrifugeer het bij 8.000 x g voor 15 s en negeren de doorstroming.
- 500 μL van wassen buffer van toepassing op de RNA zuivering kolom samen en Centrifugeer het bij 8.000 x g gedurende 2 minuten.
- Plaats de kolom in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
- Voeg 50 l RNase-vrije H2O en Incubeer de kolom bij kamertemperatuur voor 1 min.
- Centrifugeer het bij de maximale snelheid voor 1 min aan elueer de RNA.
- Meet de extinctie van de RNA op 260 nm in een spectrofotometer, met behulp van 3 μl van het eluted monster. Gebruik dezelfde hoeveelheid H2O als een leeg.
- Het bepalen van het exemplaaraantal van de gesynthetiseerde DENV 3' UTR RNA. 1 ng van DENV 3' UTR RNA (462 baseert, Figuur 2) is vergelijkbaar met 4.05 x 109 exemplaren.
- De RNA-norm-80 ° C bewaren tot gebruik.
3. de verwerking van Virus monsters voor RT-qPCR
Opmerking: De stappen 3.1-3.3 zijn moet worden uitgevoerd binnen een biologische veiligheidskast. In het bijzonder, moet behandeling van het supernatant van cultuur met een besmettelijke virus plaatsvinden in de omgeving van bioveiligheid niveau 2 (of hoger).
- Mix-199 μL van de buffer van een verwerking en 1 μL van de nuclease-vrije proteïnase K.
- Serieel verdund gesynthetiseerd DENV 3' UTR RNA (uit stap 2.6) 1:10 tot het verkrijgen van 5 x 10,9 tot en met 5 x 10,3 kopieën/μl van het standaard gebruik van RNA cel kweekmedium (b.v.DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum en antibiotica [DMEM/10% FBS]) bevattende 40 eenheden/mL RNase Inhibitor van de omwenteling.
- Meng 5 μL van de bovendrijvende substantie de cultuur van DENV-geïnfecteerde cellen en de standaard DENV 3' UTR RNA met 5 μL van de verwerking van de buffer/proteïnase K oplossing (uit stap 3.1) met behulp van 8-buis PCR strips of een 96-Wells PCR plaat. Als een besturingselement niet-template (NTC), mix 5 μL van cel kweekmedium (dat wil zeggen, geen virus is inbegrepen) met 5 μL van de oplossing van de buffer/proteïnase K verwerking.
- Na een kort centrifugeren, Incubeer de monsters in een thermocycler met behulp van de volgende voorwaarden: 1 cyclus (van 25 ° C gedurende 10 minuten en 75 ° C gedurende 5 minuten).
Opmerking: Verwerkte monsters kunnen worden bewaard bij 4 ° C als de real-time PCR-analyse wordt gedaan op dezelfde dag. Voor langdurige opslag, moeten de monsters worden opgeslagen bij-80 ° C.
4. real-time PCR analyse
Opmerking: Het is sterk aanbevolen om stappen 4.1-4.4 binnen een schone kap om te minimaliseren van de besmetting van amplicon-gerelateerde producten of RNase.
- Voorbereiding van een master mix van RT-qPCR met een one-step RT-PCR-reagens (Tabel van materialen) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge (RNase-vrij) met DENV-3' UTR-specifieke primers en een fluorogenic-sonde (tabellen 1). Schaal omhoog het volume van elke component (tabel 4) volgens 11% meer van het totale aantal monsters, met inbegrip van de standaard RNA en NTC reacties.
- Aliquot 8 μL van de master mix in de put in een 96-Wells real-time PCR-plaat (Tabel van materialen) moeten worden gebruikt.
- Kort centrifugeren van de verwerkte monsters, met inbegrip van de DENV 3' UTR RNA standaard en NTC (uit stap 3.4) en voeg 2 μL van de monsters toe aan elk putje van de 96-Wells real-time PCR-plaat.
- Afdichten van de PCR-plaat met optisch duidelijk kleeffilm.
- Kort centrifugeren de plaat duikt met 200 x g luchtbellen te verwijderen.
- Plaats de plaat in een real-time PCR-instrument en cyclus van de plaat met behulp van de volgende voorwaarden: 1 cyclus van de RT etappe (25 ° C gedurende 10 minuten), 1 cyclus van de polymerase activering fase (95 ° C gedurende 2 min), 40 cycli van de etappe versterking (95 ° C voor 10 s en 60 ° C gedurende 30 s [één data-acquisitie bij deze stap]).
- Bepalen van het exemplaaraantal van de DENV-RNA in monsters met behulp van een real-time PCR-geassocieerde software.
- Toewijzen in het venster Setup de waterput van een reactie die moet worden geanalyseerd als onbekend monster.
- De waterput van de serieel verdunde DENV 3' UTR RNA als standaard toewijzen en typt u de verwachte exemplaaraantal van RNA standaard in elk putje (bijvoorbeeldals 5 x 103 kopieën/μL van RNA standaardoplossing worden gebruikt, typt u 5.000). Het toewijzen van de put als Negatieve controle voor NTC.
- In het venster analyse , klik op analyseren en ervoor te zorgen dat de correlatiecoëfficiënt (R2) van de standaard curve gegenereerd gelijk aan of groter dan 0,98 is.
- In het algemeen gebruik de standaardinstellingen voor de Ct (drempel: auto, de cyclus van de begindatum van de basislijn: auto, basislijn einde cyclus: auto) voor analyse.
Opmerking: De exemplaaraantal van onbekende monsters worden automatisch berekend op basis van de drempelwaarden van de cyclus (Ct) van de individuele reacties. De berekende exemplaaraantal van elk monster wordt beschouwd als RNA kopieën per 10 μL RT-qPCR reactie (bijvoorbeeldals 12,345 in een onbekend monster is aangegeven, dit betekent dat 12,345 kopieën van DENV RNA in aanwezig zijn de reactie).
Representative Results
Voor de kwantificering van DENV RNA door analyse van de RT-qPCR, een norm van de bekende exemplaaraantal, die kan worden gedetecteerd door de dezelfde primer ingesteld, is een voorwaarde. In dit protocol, de 462 nucleotide-lang RNA met de 3 'UTR opeenvolging van de DENV-2 NGC stam was in vitro transcriptie van RNA T7 promotor-gesmolten DENV-2-3' UTR DNA sjabloon, die was versterkt door PCR en gezuiverd (figuur 2A en 2B). Wanneer een seriële 10-fold verdunning van de standaard DENV RNA (van 5 x 10,9 tot 5 x 102 exemplaren in een reactie van de RT-qPCR 10 μL) werd onderworpen aan een directe analyse van de RT-qPCR met 3' UTR-specifieke primers en een fluorogenic sonde9, een lineaire curve met een goede correlatiecoëfficiënt (R2 = 0.98726) werd verkregen (figuur 2C).
Vervolgens werd deze directe bepaling van de RT-qPCR toegepast om te kwantificeren van de DENV in het supernatant van cultuur van virus-geïnfecteerde cellen. DENV-2 (Singapore isoleren EDEN2 329510), die had zijn doorgegeven in C6/36 mug cellen en getitreerd met plaque assay met behulp van BHK-21 cellen11, was serieel verdund (van 8 x 106 tot 80 plaque vorming eenheden [PFU] /mL). DENV monsters werden vervolgens behandeld met een gelijke hoeveelheid verwerking buffer met proteïnase K om te deproteinize virionen en onderworpen aan een directe bepaling van de RT-qPCR gericht op de DENV 3' UTR RNA volgorde. Nogmaals, een goede correlatie (R2 = 0.99981) tussen de besmettelijke DENV-titer en de Ct, een cyclus-getal dat wordt beschouwd als het punt waar het fluorescent signaal met exponentiële groei boven de achtergrond stijgt, werd verkregen (figuur 3A). Wanneer de Ct-waarden die zijn gegenereerd uit een seriële verdunning van de DENV-materieel met bekende besmettelijke titers werden uitgezet op de standaard curve gemaakt met in vitro getranscribeerd 3' UTR RNA, alle van de percelen verkregen 8 x 106 tot 80 PFU/mL (gelijk aan 8 x 10,3 tot en met 8 x 10-2 PFU in een 10 μL RT-qPCR reactie) waren binnen het bereik van die onderworpen aan standaard RNA (5 x 10,9 tot en met 5 x 10,3 opgehaald in een 10 μL RT-qPCR reactie, figuur 3B), die aangeeft dat DENV monsters met een breed scala van besmettelijke titers kunnen worden geanalyseerd op hetzelfde moment, met behulp van deze directe RT-qPCR. In parallel experimenten, werd het effect van de verwerking van buffer of proteïnase K behandeling op de detectie van virale RNA door RT-qPCR analyse onderzocht. Hoewel de behandeling van een logboek verdunning van het monster met DENV (8 x 10,6 tot 8 x 102 PFU/mL) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) alleen voorafgaand aan de RT-qPCR (1:1 verdunning van het monster van het virus met PBS) en een incubatie van 25 ° C gedurende 10 minuten en 75 ° C gedurende 5 min ontlokte een regressie-curve (Figuur 3 c, zwarte lijn), en de gemiddelde Ct-waarden, verkregen door de behandeling van PBS werden vertraagd 2.6-3.2 cycli in vergelijking met de Ct verkregen door verwerking van buffer/proteïnase K behandeling (Figuur 3 c, gestippelde lijn). Bovendien kon de hoogste verdunning van het virus (8 x 102 van PFU/mL [8 x 10-1 PFU per 10 μL RT-qPCR reactie]) niet worden opgespoord met deze PBS behandeling (Figuur 3 c). Bij gebrek aan proteïnase K tijdens de verwerking buffer behandeling (Figuur 3 c, grijze lijn), werd een soortgelijke regressie gegenereerd; echter de vertragingbij versterking (0.1-0.8 cycli) nog steeds werd waargenomen ten opzichte van de verwerking reactie met proteïnase K (Figuur 3 c, gestippelde lijn). Deze gegevens wijzen erop dat, onder de voorwaarden getest, behandeling van het monster DENV met verwerking buffer samen met proteïnase K de gevoeligheid van de test van de RT-qPCR verbetert.
De directe bepaling van de RT-qPCR werd verdere voor de toepasbaarheid op het valideren van antivirale middelen tegen DENV beoordeeld. Mycophenolic zuur (MPA), een nonnucleoside-remmer van inosine monofosfaat dehydrogenase, die wordt gebruikt als een immuunsuppressivum in transplantatie, is gemeld voor de remming van DENV in vitro12,13. Hoewel de vorige studies een conventionele plaque-test of een stroom cytometry assay voor het detecteren van virale antigenen om aan te tonen het remmende effect van MPA op DENV infectie12,13in dienst, in de huidige studie werd direct RT-qPCR toegepast om te evalueren van de MPA's antivirale activiteit. HeLa cellen, die had zijn zaadjes bij een dichtheid van 5 x 10,4 cellen per putje in een 24-well bord 1 dag voorafgaand aan de infectie, werden blootgesteld aan DENV-2 op een MOI van 1 voor 1 h en, na het wassen, gekweekt met DMEM/10% FBS in aanwezigheid van 50 – 0.016 μg/mL MPA) of 0,1% dimethylsulfoxide [DMSO]). Het supernatant cultuur was 3 dagen na infectie verzameld en onderworpen aan de directe bepaling van de RT-qPCR met DENV 3' UTR specifieke primers en een fluorescente sonde. Figuur 4 toont de DENV RNA kopieën (per reactie) in het supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen met toenemende concentraties van MPA, die werden vastgesteld door een in vitro getranscribeerd 3' UTR RNA standaard behandeld. Met een behandeling van 50 μg/mL (156 μM) MPA, een verlaging tot 99.87 ± 0,02% van de cultuur van DMSO-behandelde controle werd waargenomen (Figuur 4). Nog belangrijker is, de IC50 (50% remmende concentratie) waarde voor MPA bepaald door de gegevens die zijn weergegeven in Figuur 4 was 0.79 μM, die vergelijkbaar met de waarden is eerder gemelde12,,13. Dit resultaat geeft dus aan dat deze directe bepaling van de RT-qPCR een nuttig en betrouwbare methode is voor de beoordeling van het remmende effect van antivirale middelen op DENV-infectie.
Tot slot, de toepassingen van de directe bepaling van de RT-qPCR voor andere RNA virussen werden getest. Wanneer een voorraad van gele koorts virus (YFV) 17D vaccinstam (Flavivirus), die had zijn versterkt in Vero-cellen en getitreerd op BHK-21-cellen, was onderworpen aan direct met behulp van de RT-qPCR sonde YFV-17 D-specifieke primers en een fluorogenic14, als beschreven in tabel 1, kan een standaard kromme met goede directe correlatie tussen virus titers en Ct-waarden worden gegenereerd met een 10-fold seriële verdunning van de virus-voorraad (3.2 x 105 tot 3.2 PFU/mL, figuur 5A). Ook directe analyse van de RT-qPCR van Chikungunya-virus (CHIKV, Togaviridae) Ross stam voorraad, die had zijn versterkt in Vero-cellen en getitreerd op BHK-21-cellen, met behulp van CHIKV-specifieke primers en een fluorogenic sonde15 (tabel 1), gaf een goede regressie tussen besmettelijke titers (4.4 x 108 tot en met 4.4 x 103 PFU/mL) en Ct-waarden (figuur 5B). Dit was ook het geval voor de detectie van een seriële verdunning (8 x 10-2 tot 8 x 10-2 PFU/mL, figuur 5C) van het mazelenvirus (MeV, Paramyxoviridae) die hadden doorgegeven en getitreerd met Vero-cellen, met behulp van eerder gerapporteerde primers en een fluorogenic sonde16 (tabel 1). Deze gegevens tonen aan dat het aanpassingsvermogen van de directe bepaling van de RT-qPCR voor de kwantitatieve detectie van verschillende RNA virussen.
Figuur 1: Workflow van de directe bepaling van de RT-qPCR. Het supernatant van cultuur van DENV-geïnfecteerde cellen wordt behandeld met een buffer van de verwerking met proteïnase K om virale RNA (monster-stap) vrij te geven. Vervolgens wordt het verwerkte monster gemengd met een one-step RT-PCR reagens en onderworpen aan de real-time PCR-test met DENV-3' UTR-specifieke primers en een fluorogenic-sonde. De niveaus van viraal RNA gedetecteerd in de respectieve monsters kunnen worden vastgesteld door een serieel verdunde standaard gebruik van in vitro getranscribeerd DENV-RNA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: een standaard curve gegenereerd door DENV 3' UTR RNA. (A) standaard RNA met 3' UTR van DENV-2 NGC was getranscribeerde in vitro van een T7 RNA promotor sequentie-gesmolten PCR fragment. (B) Purified DENV 3' UTR-RNA (250 ng) werd gevisualiseerd op een 1% agarose gel (rechterbaan). De linker rijstrook toont de molecuulgewicht markering voor RNA elektroforese. (C) A log verdunning van de DENV-3 'UTR RNA standaard werd behandeld met de buffer van de verwerking met proteïnase K en onderworpen aan een real-time PCR-analyse met behulp van een one-step RT-qPCR reagens en DENV-3' UTR-specifieke primers en een fluorogenic-sonde set. De gemiddelde Ct-waarden (n = 3) verkregen respectieve verdunningen werden uitgezet tegen de geschatte hoeveelheid van 3' UTR RNA (5 x 10,9 tot en met 5 x 102 RNA wordt gekopieerd in een 10 μL RT-qPCR reactie). R-2 is de correlatiecoëfficiënt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: de kwantificering van DENV RNA virus voorraad door directe RT-qPCR. (A) de middelbare-titer DENV-2 voorraad geproduceerd in C6/36 cellen was serieel 10-fold verdund (8 x 10,6 tot 8 x 101 PFU/mL) die met DMEM/10% FBS bevatten een RNase-remmer en onderworpen aan de directe bepaling van de RT-qPCR met DENV-3' UTR-specifieke primers /probe. (B) Ct waarden verkregen door RT-qPCR van de log-verdund DENV voorraad (cirkels) werden uitgezet op een standaard curve van de 3'-UTR RNA (driehoeken) getranscribeerd in vitro. Het gebruik van 8 x 106 PFU/mL voorraad in een directe bepaling van de RT-qPCR komt overeen met 8 x 103 PFU van virus in een 10 μL RT-qPCR reactie. (C) dit paneel toont het effect van de verwerking van buffer en proteïnase K behandelingen op de detectie van virale RNA. DENV verdund voorraad (8 x 10,6 tot 8 x 102 PFU/mL) was geïncubeerd met een gelijke hoeveelheid verwerking buffer met proteïnase K (witte cirkels), verwerking van buffer alleen (grijze cirkels) en PBS (zwarte cirkels) en klik vervolgens onderworpen aan de directe RT-qPCR assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: evaluatie van de remmende werking van het MPA door directe RT-qPCR. HeLa cellen besmet waren met DENV-2 op een MOI van 1 en gekweekte in het bijzijn van de toenemende concentraties van MPA, een eerder gemelde inhibitor van DENV (of 0,1% DMSO). Drie dagen na infectie, werden cultuur supernatant van de geïnfecteerde cellen verzameld en onderworpen aan de directe bepaling van de RT-qPCR met DENV 3' UTR-specifieke primers/sonde. Het exemplaaraantal van virale RNA werd bepaald door DENV 3' UTR RNA standaard getranscribeerde in vitro. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: de toepassing van directe RT-qPCR voor de opsporing van andere RNA virussen. Serieel verdunde virusvoorraden van (A) YFV, (B) CHIKV en (C) MeV werden onderworpen aan de directe bepaling van de RT-qPCR met behulp van PCR inleidingen en fluorogenic sondes specifiek voor hun respectieve virale RNA opeenvolgingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Doel | Naam | Volgorde (5' - 3') | Opmerking |
| T7 promotor-gesmolten DENV-2-3'UTR cDNA versterking | T7-DENV 3' UTR Fwd | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGc gaa tTA GAA GGC AAA ACT AAC ATG AAA | Cursief, T7 promotor; kleine letters, spacer; vet, DENV-2 NGC nucleotiden 10,270-10,292 |
| DENV 3' UTR Rvs | AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC | DENV-2 NGC nucleotiden 10,723-10,703 | |
| RT-qPCR analyse van DENV | UTR F DENV-2 3' | AAG GAC TAG AGG TTA GAG GAG ACC C | Referentie 9 |
| UTR R DENV-2 3' | GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA GS | ||
| Sonde 2 Den-2-4 | 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA AAG ACC-TAMRA | ||
| RT-qPCR analyse van YFV | YFV NS5 F | GAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT | Referentie 14 |
| YFV NS5 R | GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G | ||
| YFV NS5 sonde | 6FAM-CTA CGT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-TAMRA | ||
| RT-qPCR analyse van CHIKV | CHIK E1 F | TCG ACG CGC CCT CTT TAA | Referentie 15 |
| CHIK E1 R | ATC GAA TGC ACC GCA CAC T | ||
| CHIK E1 P | 6FAM-ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-TAMRA | ||
| RT-qPCR analyse van MeV | MeV N F | TGG KAT CTG AAC TCG GTA TCA C | Referentie 16 |
| MeV N R | TGT CCT CAG TAG TAT GCA TTG CAA | ||
| MeV N P | 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA |
Tabel 1: Oligonucleotide primers en fluorogenic sonde sequenties gebruikt in deze studie.
| Onderdelen | Voorraad concentratie | Volume (l) | Eindconcentratie |
| PrimeSTAR Max Premix | 2 x | 25 | 1 x |
| T7-DENV 3' UTR Fwd | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| DENV 3' UTR Rvs | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| pEU/DENV 3' UTR | 1 ng/μL | 1 | 20 pg/μL |
| H2O Nuclease-gratis | 4 | ||
| Totaal | 50 |
Tabel 2: Meng de componenten van een PCR voor de bereiding van DENV 3' UTR sjabloon DNA.
| Onderdelen | Voorraad concentratie | Volume (l) | Eindconcentratie |
| T7 sequentie-gesmolten DENV 3' UTR DNA sjabloon | (variabel) | x | 100 ng per reactie |
| ATP oplossing | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| CTP oplossing | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| GTP oplossing | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| UTP-oplossing | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| Reactie Buffer | 10 x | 2 | 1 x |
| T7 Enzym Mix | 2 | ||
| Recombinante RNase Inhibitor | 40 eenheden/μL | 1 | 2 eenheden/μL |
| H2O Nuclease-gratis | 7 - x | ||
| Totaal | 20 |
Tabel 3: Onderdelen van een IVT Meng voor de standaard DENV 3' UTR RNA synthese.
| Onderdelen | Voorraad concentratie | Volume (l) | Eindconcentratie in een RT-qPCR-reactie |
| iTaq universele sondes reactie mix | 2 x | 5,00 | 1 x |
| iScript geavanceerde reverse-transcriptase | 40 x | 0,25 | 100 ng per reactie |
| Primer/sonde mix | DENV-2 3' UTR F: 3 ΜM | 1,00 | 300 nM |
| DENV-2 3' UTR R: 3 ΜM | 300 nM | ||
| Sonde 2 Den-2-4: 2 μM | 200 nM | ||
| H2O Nuclease-gratis | 1,75 | ||
| Subtotaal | 8,00 |
Tabel 4: onderdelen van een master mix voor real-time analyse van de RT-qPCR van DENV RNA. Merk op dat 2 μL van de verwerkte DENV monster (of standaard RNA) moet worden toegevoegd aan de 8-μL master mix (een totaal van 10 μL per reactie).
Discussion
Vandaag, wordt virale nucleïnezuur detectie door fluorescentie gebaseerde PCR in real time steeds een gouden standaard voor de moleculaire diagnose van pathogene menselijke virussen, toe te schrijven aan zijn gevoeligheid en snelheid7. Dit is vooral belangrijk voor het bevestigen van de virusbesmetting in de vroege fase van acute besmettelijke ziekten zoals dengue koorts17. Ook op het gebied van fundamenteel DNEV onderzoek is RT-qPCR assay een onmisbaar instrument voor het controleren van de replicatie van het virus in in vitro cultuur, die tot een goed begrip van de biologie van de replicatie van DENV en de ontdekking van antivirale remmers leiden zal. In deze studie werd de TL gebaseerde real-time PCR-test verder ontwikkeld door een combinatie van een verwerking buffer en een one-step RT-PCR reagens zodat DENV RNA in het supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen kon worden gekwantificeerd door RT-qPCR zonder zuiveren het virale RNA genoom. In vergelijking met routinematige testen voor speurder virus replicatie, zoals plaque-test, ELISA of conventionele RT-qPCR dienst nemen RNA zuivering6,7, een vereenvoudigde protocol van de RT-qPCR bepaling resulteerde in een grote vermindering van de tijd en Stapsgewijze instructies voor het kwantificeren van DENV-RNA. Dit is ook een belangrijk kenmerk dat voordelen heeft bij het minimaliseren van de besmetting en het verlies van genetische materialen. Toch moet opgemerkt worden dat het gebruik van een schone kap essentieel in de opzet van de IVT (stap 2.1) en RT-qPCR (stappen 4.1-4.4) Reacties is te vermijden de kruisbesmetting van amplicon-gerelateerde producten of RNase. Het is ook van cruciaal belang om de cultuur supernatant, met inbegrip van besmettelijke virus, binnen een kabinet bioveiligheid (stap 3.3) om een risico van laboratorium infectie te verminderen.
Een andere betekenis van de directe bepaling van de RT-qPCR is dat een breed scala van virale RNA exemplaren tegelijk zonder verdunning of concentratie van het monster kan worden geanalyseerd. Wanneer een serieel verdunde DENV 3' UTR RNA standaard werd gebruikt, het directe RT-qPCR-protocol geproduceerd een standaard lineaire curve over zeven ordes van grootte, en de ondergrens van de kwantificering was 500 exemplaren van de RNA (Figuur 2). Voor de detectie van DENV in het supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen, 8 x 10,3 tot en met 8 x 10-2 PFU virussen in een 10 μL RT-qPCR waren binnen het bereik van DENV 3' UTR RNA standaard, en de onderste detectiegrens (8 x 10-2 van PFU) werd berekend bevat 11 , 400 ± 7,077 RNA exemplaren (figuur 3B). Van de nota, zoals gemeld in verschillende flavivirus studies18,19,20, werd de grotere verhouding van virale RNA kopieën te virus besmettelijk titer (d.w.z., PFU) in DENV monsters ook waargenomen in deze studie. Deze overschatting wordt ervan uitgegaan dat grotendeels te wijten aan de aanwezigheid van defect (dat wil zeggen, niet-infectieuze) virussen of gratis virale RNA vrijgelaten uit besmette en dode cellen. Hoewel de verhouding van RNA kopieën: PFU in deze studie verkregen (1.1 x 105 tot en met 1.3 x 105 RNA kopieën/PFU) was onverenigbaar is met de gegevens die eerder weergegeven (ratio's variëren van 1 tot 3 log)21,20, dit kan worden toegeschreven aan het verschil in virusstammen, cellen en kweekomstandigheden werkzaam. Een andere waarschijnlijke verklaring voor de discrepantie is dat, aangezien geen RNA zuiveringsproces bij de directe RT-qPCR bepaling hierin beschreven betrokken was, meer DENV RNA in het supernatant van cultuur kon worden opgespoord door middel van real-time PCR analyse zonder verlies van virale genetische materialen.
De eenvoud van de directe RT-qPCR verbetert de mogelijkheid om een groot aantal monsters in multi goed formaten, zoals een 96-wells-plaat. Daarom is deze eigenschap zal helpen de toekomstige toepassing van de directe bepaling van de RT-qPCR op een studie van de high-throughput screening voor de ontdekking van anti-DENV drugs. Inderdaad, in dit verslag, toepassing van de directe bepaling van de RT-qPCR voor de validatie van een anti-DENV-remmer, MPA, werd onderzocht, en het resultaat toonde aan dat een IC50 waarde van MPA verkregen door de directe bepaling van de RT-qPCR (Figuur 4) vergelijkbaar is met die gerapporteerd in eerdere studies met behulp van de12,13van de bepaling van de plaque. Dit toont aan dat directe RT-qPCR een nuttig assay is voor het remmende effect van antivirale middelen op de juiste manier te evalueren en in een drug screening van studie in de toekomst kan worden aangenomen.
In deze studie werden pogingen gedaan om gelden de directe RT-qPCR voor de opsporing van andere RNA-virussen. Zoals aangegeven in Figuur 5, wanneer 10-fold verdunningen van drie andere RNA virussen (YFV, CHIKV en MeV) ingedeeld in verschillende geslachten (Flavivirus, Togaviridaeen Paramyxoviridae, respectievelijk) werden onderzocht met behulp van eerder sondes gerapporteerde primers en fluorogenic specifiek voor de respectieve virale RNA opeenvolgingen. Goede correlaties tussen besmettelijke titers en Ct-waarden werden verkregen door rechtstreekse RT-qPCR testen en de correlaties werden 4-6 lineaire ordes van grootte. Dit suggereert dat het directe RT-qPCR-protocol aanpasbaar aan verschillende soorten van RNA-virussen is door simpelweg het veranderen van de virus-specifieke primers en fluorogenic sondes.
Niettemin, de gevoeligheid van detectie gevarieerd onder de virussen getest in deze studie (Figuur 5). Een wijziging van het protocol dat de detectie van doel virus RNA kan verbeteren moet een nieuwe set primer/sonde sequenties gebruikt. Daarnaast is een belangrijke stap voor de succesvolle directe RT-qPCR assay wordt beschouwd als de efficiënte introductie van het virale genoom tijdens het monster verwerking stap (stap 3.1-3.4). Dit zou van bijzonder belang voor de kwantitatieve detectie van stabiele virussen zoals een virus niet-gehuld. Hoewel het als een apart experiment, Coxsackievirus B3 (CVB3), een niet-gehuld-RNA-virus behorend tot Picornaviridae, werd onderworpen aan de directe bepaling van de RT-qPCR met behulp van de eerder beschreven CVB3-specifieke primers en fluorescente sonde22, een positieve signaal van de amplicon kon niet worden herkend zelfs met een hoge titer (1 x 105 van PFU/mL) virus voorraad. Dit wordt beschouwd als grotendeels worden toegeschreven aan de hoge fysieke integriteit van het virus niet-gehuld. Tot nu toe enkele RT-PCR-tests dat vereisen geen zuivering van nucleic zuur zijn ontwikkeld om te detecteren van verschillende RNA-virussen, die verschillende protocollen in de RNA-release in dienst stap23,24,25, 26. dus, gebruik van de alternatieve (of extra) behandelingen, zoals een incubatie van een virus steekproef bij een hoge temperatuur, potentieel verhoogt de gevoeligheid van detectie.
Kortom was de directe RT-qPCR-protocol dat is ontwikkeld in deze studie een eenvoudige en snelle maar betrouwbare methode voor het kwantificeren van de virale RNA in een cultuur supernatant van geïnfecteerde cellen. Vanwege deze eenvoud, konden de directe bepaling van de RT-qPCR een aantal monsters in een korte tijd, die belofte voor de analyse van de high-throughput van virus replicatie houdt verwerken. Bovendien was de toepassing van het directe RT-qPCR-protocol voor andere RNA virussen ook aangetoond. Deze aanpak moet daarom een nuttig instrument voor efficiënt toezicht op de RNA-virus-infecties in een instelling van de laboratorium onderzoek en eventueel in de klinische diagnose.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Subhash G. Vasudevan (Onderzoekschool Medical Duke-NUS, Singapore) voor de DENV-2 isoleren EDEN2 3295 en Shunro Imura (Kobe quarantaine Station, Japan) voor de YFV 17D vaccinstam. De auteurs zijn ook dankbaar voor de leden van het departement microbiologie en infectiecontrole voor hun hulp. Dit werk wordt ondersteund door MEXT KAKENHI Grant nummer JP16737900.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| 6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
| 2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
| Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
| illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
| CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
| Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | >600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
References
- Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).
- Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
- Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. How does Zika virus cause microcephaly? Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).
- Guzman, M. G., Harris, E. Dengue. Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).
- Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development. Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).
- Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. Tissue culture techniques for the study of dengue viruses. Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).
- Tang, K. F., Ooi, E. E.
- Suzuki, Y., et al. Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).
- Callahan, J. D., et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).
- Low, J. G., et al. Early Dengue infection and outcome study (EDEN) - study design and preliminary findings. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).
- Hishiki, T., et al. Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).
- Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology. 304 (2), 211-221 (2002).
- Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).
- Akondy, R. S., et al. Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).
- Edwards, C. J., et al. Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus. Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).
- Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).
- Peeling, R. W., et al.
- Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).
- Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. 4th Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).
- Wang, W. K., et al. Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).
- Gnadig, N. F., et al. Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).
- Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).
- Pastorino, B., et al. Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses. Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).
- Nishimura, N., et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).
- Kang, K., et al. A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification. Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).
