Summary

Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

Published: September 28, 2018
doi:

Summary

Um protocolo para a elucidação da planta tilacoides proteína complexa organização e composição com poliacrilamida nativa azul gel eletroforese (BN-página) e 2D-SDS-PAGE é descrito. O protocolo é otimizado para a Arabidopsis thaliana, , mas pode ser usado para outras espécies de plantas com pequenas modificações.

Abstract

Cadeia de transferência de elétrons fotossintética (ETC) converte energia solar em energia química na forma de NADPH e ATP. Quatro grandes complexos de proteínas incorporado em tilacoides membrana colheita solar energia para conduzir os elétrons da água para NADP+ através de dois fotossistemas e usar o gradiente de prótons criado para a produção de ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b6f (Cyt b6f) e ATPase são todos os complexos Multiproteicos com orientação distinta e dinâmica na membrana tilacoides. Informações valiosas sobre a composição e as interações dos complexos proteína na membrana tilacoides podem ser obtidas pelo solubilizing os complexos da integridade da membrana por detergentes suaves, seguidos pelo nativo gel de separação eletroforética do complexos. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método analítico usado para a separação de complexos de proteínas em sua forma nativa e funcional. O método pode ser usado para purificação de complexo de proteínas para análise estrutural mais detalhada, mas ele também fornece uma ferramenta para dissecar as interações dinâmicas entre os complexos de proteína. O método foi desenvolvido para a análise de complexos de proteína respiratória mitocondrial, mas desde então foi otimizado e melhorado para a dissecação dos complexos proteína tilacoides. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado atualizado para análise de complexos de proteínas fotossintéticas lábeis e suas interações em Arabidopsis thaliana.

Introduction

Proteína multisubunit grandes complexos fotossistema PSI e PSII, Cyt b6f e ATPase coordenam a produção de NADPH e ATP em reações de luz fotossintéticas. Nos cloroplastos de plantas superiores, os complexos estão localizados na membrana tilacoides, que é uma estrutura de membrana estruturalmente heterogêneo, composto por grana apresso e não-apresso estroma contém. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método amplamente utilizado na análise de grandes multisubunit complexos de proteínas em sua forma nativa e biologicamente ativo. O método foi criado para a dissecção da proteína de membrana mitocondrial complexos1, mas mais tarde foi personalizado para a separação dos complexos da proteína da membrana tilacoides rede3. O método é adequado (i) para a purificação de complexos de proteínas tilacoides individuais para análise estrutural, (ii) para determinar o nativas interações entre complexos de proteína e (iii) a análise da organização geral dos complexos da proteína Após alterar as sugestões ambientais.

Antes da separação, complexos da proteína são isolados da membrana com detergentes não iônicos cuidadosamente escolhidos, que são geralmente leves e preservar a estrutura nativa dos complexos da proteína. Detergentes contêm hidrofóbicos e hidrofílicos sites e micelas estável de forma acima de uma determinada concentração, chamado uma concentração crítica de micellar (CMC). Aumentando a concentração de detergente acima dos resultados CMC no rompimento das interações lipid-lipídico e a solubilização dos complexos da proteína. A escolha do detergente depende a estabilidade da proteína complexa de interesse e a capacidade de solubilização de detergente. Rotineiramente utilizados detergentes incluem α/β-dodecil-maltoside e digitonin. Após a solubilização dos complexos de proteína no seu estado nativo, material insolúvel é removido por centrifugação. Em plantas superiores, a membrana tilacoides é altamente heterogêneo em estrutura e alguns detergentes (por exemplo, digitonin) solubilizar seletivamente apenas uma fração específica da membrana3. Portanto, para caracterizar as interações entre os complexos de proteína ou proteína complexa organização, é crucial determinar sempre a capacidade de solubilização de detergente escolhido, determinando-se o teor de clorofila e a clorofila a/b relação de sobrenadante para avaliar o rendimento e o domínio representado tilacoides (sub), respectivamente, da fração solubilized. A clorofila a/b relação contém intacta de crescimento-luz acclimated plantas normalmente é em torno de 3, Considerando que a chl um / b valor de tilacoides frações enriquecidas em grana ou estroma contém cai abaixo (~ 2.5) ou superior (~ 4,5) o valor do total contém, respectivamente.

Para fornecer uma carga negativa para os complexos de proteína, a tintura de (CBB) azul brilhante de Coomassie é adicionada à amostra solubilized. Devido a mudança de carga, complexos de proteínas migram para o ânodo e são separados em um gradiente de acrilamida (AA) de acordo com sua massa molecular e a forma. Separação eficaz e de alta resolução é conseguida usando um gradiente de concentração de acrilamida linear. Durante a eletroforese, os complexos de proteína migram para o ânodo até atingirem o limite de tamanho de poro dependente do tamanho. O tamanho dos poros do gel de polyacrylamide depende (i) a acrilamida total /bis– acrilamida concentração (T) e (ii) sobre a cross-linker bis– acrilamida monômero concentração (C) em relação a monômeros total4. Após a separação com BN-página, os complexos de proteína podem ser subdivididos em suas subunidades de proteínas individuais por segunda dimensão (2D) – SDS – PAGE. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por BN-página/2D-SDS-PAGE.

Protocol

1. preparar BN1,2,3 do Gel Configure o rodízio de gel com placas de 8 x 10 cm (vidro retangular e placa entalhada da alumina) de acordo com as instruções do fabricante usando espaçadores de 0,75 mm. Coloque num prato de agitar um mixer gradiente e conectá-lo com a bomba peristáltica por uma tubulação. Anexar uma agulha da seringa para a outra extremidade do tubo e col…

Representative Results

Um sistema representativo de 2D-BN/SDS-PAGE na Figura 1 demonstra a separação de digitonin e complexos de proteína β-DM-solubilizado tilacoides e sua composição de subunidade de proteína detalhadas. O padrão complexo de proteínas de digitonin solubilizado contém (gel de horizontal na parte superior no topo da figura 1A) contém a megacomplex do FSII LHCII-PSI, duas grandes razões do FSII-LHCII (sc), supercomplex PSI-LH…

Discussion

As máquinas de conversão de energia fotossintética é composta por grandes multisubunit complexos de proteínas, que são encaixados na membrana tilacoides. Este protocolo descreve um método básico para análise dos complexos proteína vegetal tilacoides de Arabidopsis thaliana com BN-página combinada com 2D-SDS-PAGE. O protocolo é também adequado para a análise de complexos de proteínas tilacoides de tabaco e espinafre contém, mas pode precisar de pequenos ajustes.

Para a …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pela Academia da Finlândia (números do projeto 307335 e 303757) e Energia Solar no acordo de subvenção de biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). O protocolo é baseado na referência3.

Materials

6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. , 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -. M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).

Play Video

Cite This Article
Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

View Video