Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu

Grandes sous-unités protéiques complexes photosystème PSI et PSII, Cyt b₆f et ATPase coordonnent la production de NADPH et d’ATP dans les réactions photosynthétiques de lumière. Dans les chloroplastes de plantes supérieures, les complexes sont situés dans la membrane des thylakoïdes, qui est une structure de membrane structurellement hétérogène, composée de grana accollées et non accolées stroma thylakoïdes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode largement utilisée dans l’analyse des grandes sous-unités protéiques complexes dans leur forme native et biologiquement active. La méthode a été établie pour la dissection de la membrane mitochondriale protéine complexes¹, mais plus tard a été personnalisée pour la séparation des complexes protéiques de la membrane thylakoïde réseau³. La méthode est appropriée (i) pour la purification de complexes protéiques thylakoïdes individuels pour l’analyse structurale, (ii) pour determiner natives interactions complexes protéiques et (iii) l’analyse de l’ensemble de l’Organisation des complexes protéiques sur l’évolution des signaux environnementaux.

Avant la séparation, complexes protéiques sont isolées de la membrane avec des détergents non ioniques soigneusement choisis, qui sont généralement bénins et de préserver la structure native des complexes protéiques. Détergents contiennent hydrophobes et hydrophiles sites et micelles stable forme au-dessus d’une certaine concentration, appelée une concentration micellaire critique (CMC). Augmentation de la concentration de détergent au-dessus des résultats de CMC dans la perturbation des interactions lipides-lipides et la solubilisation des complexes protéiques. Le choix du détergent dépend la stabilité de la protéine complexe d’intérêt et les capacités de solubilisation du détergent. Les détergents utilisés couramment sont α/β-dodécyl-maltoside et digitonine. Suite à la solubilisation des complexes de protéines dans leur état natif, matériel insoluble est enlevé par centrifugation. Chez les plantes supérieures, la membrane thylakoïde est hautement hétérogènes dans la structure et certains détergents (p. ex., la digitonine) solubilisent sélectivement seulement une fraction spécifique de la membrane³. Par conséquent, afin de caractériser l’organisation complexe de la protéine ou les interactions entre les complexes de protéine, il est essentiel de toujours déterminer les capacités de solubilisation du détergent choisi par la détermination de la teneur en chlorophylle et la chlorophylle a/b ratio de surnageant pour évaluer le rendement et le domaine représenté thylakoïdes (void), respectivement, de la fraction solubilisée. Le ratio de la chlorophylle a/b dans les thylakoïdes intacts des plantes acclimatées croissance-lumière est généralement autour de 3, alors que la chl un / valeur b des thylakoïdes fractions enrichies en grana ou stroma thylakoïdes inférieure (~ 2,5) ou est supérieure à la valeur du total (~ 4,5) les thylakoïdes, respectivement.

Pour fournir une charge négative pour les complexes de protéine, colorant (CBB) bleu brillant de Coomassie est ajoutée à l’échantillon solubilisé. En raison de l’évolution de la charge, des complexes de protéines migrent vers l’anode et sont séparés sur un gradient d’acrylamide (AA) selon leur masse moléculaire et de la forme. La séparation efficace et à haute résolution est obtenue en utilisant un gradient de concentration d’acrylamide linéaire. Lors de l’électrophorèse, les complexes de protéines migrent vers l’anode jusqu’à ce qu’ils atteignent leur limite de taille de pore dépendant de la taille. Dépend de la taille des pores du gel de polyacrylamide (i) l’acrylamide total / concentration debis– acrylamide (T) et (ii) sur la réticulant bis– acrylamide monomère concentration (C) par rapport à des monomères total⁴. Après la séparation avec BN-PAGE, les complexes de protéine peuvent être subdivisés en leurs sous-unités de protéine individuelle par seconde dimension (2D) – SDS – PAGE. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’analyse des complexes de protéine de membrane de thylakoid de BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.