Summary

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Published: September 28, 2018
doi:

Summary

프로토콜 식물의 해명 thylakoid 단백질 복잡 한 조직 및 구성 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 및 2D SDS 페이지 설명. 애기 thaliana, 프로토콜 최적화 작은 수정으로 다른 식물 종에 대 한 사용할 수 있습니다.

Abstract

광합성 전자 전송 체인 (등) NADPH와 ATP의 형태로 화학 에너지로 태양 에너지를 변환합니다. 4 개의 큰 단백질 복합물 NADP+ photosystems 통해 두, 물에서 전자를 드라이브 하 고 생성된 된 양성자 기온 변화도 사용 하 여 ATP의 생산을 위한 thylakoid 막 수확 태양 에너지에 포함. Photosystem PSII, PSI, 시 토 크롬 b6f (Cyt b6f) 및 ATPase는 뚜렷한 방향과 thylakoid 막에서 역학으로 모든 multiprotein 복합물. 온화한 세제의 기본 젤 전기 이동 별거 다음으로 막 무결성에서 단지 solubilizing 여 구성과 thylakoid 막에서 단백질 복합물의 상호 작용에 대 한 유용한 정보를 얻을 수 있습니다는 단지입니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 기능 형태로 단백질 복합물의 분리에 사용 되는 분석 방법 이다. 자세한 구조 분석을 위해 단백질 복잡 한 정화에 대 한 메서드를 사용할 수 있습니다 하지만 그것은 또한 단백질 복합물 간의 동적 상호 작용을 해 부를 도구를 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 미토 콘 드리 아 호흡 단백질 복합물의 분석을 위해 개발 되었다 하지만 이후 되었습니다 최적화 있으며 thylakoid 단백질 복합물의 해 부에 대 한 개선. 여기, 우리가 정한 광합성 단백질 복합물 및 애기 thaliana에서 그들의 상호 작용의 분석에 대 한 상세한 최신 프로토콜을 제공합니다.

Introduction

큰 multisubunit 단백질 복합물 photosystem PSI과 PSII, Cyt b6f와 ATPase 광합성 빛 반응에서 ATP와 NADPH의 생산 조정. 더 높은 식물의 엽록체에는 단지는 구조적으로 다른 유형의 막 구조, appressed grana 및 appressed 비 기질 thylakoids thylakoid 막에 있습니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 생물학적 활성 형태로 큰 multisubunit 단백질 복합물의 분석에는 광범위 하 게 사용 되는 방법 이다. 방법1, 미토 콘 드 리아 멤브레인의 단백질 복합물 해 부에 대 한 설립 되었다 하지만 나중 thylakoid 막 네트워크3에서 단백질 복합물의 분리에 대 한 사용자 지정 된. 방법은 (i) 구조 분석, (ii) 단백질 복합물 사이 기본 상호 작용을 결정 하 고 (iii) 단백질 복합물의 전체 조직 분석에 대 한 개별 thylakoid 단백질 복합물의 정화에 적합 시 환경 큐를 변경 합니다.

이전에 분리, 단백질 복합물 신중 하 게 선택한 비 세제는 일반적으로 온화 하 고 단백질 복합물의 기본 구조를 보존 막 으로부터 격리 됩니다. 세제 소수 포함 하 고 친수성 사이트 및 특정 농도, 위의 형태 안정 micelles 라는 중요 한 micellar 농도 (CMC). CMC 결과 지질-지질 상호 작용의 고 단백질 복합물의 가용 화에 세제 농도 증가. 세제의 선택에는 세제의 가용 화 능력 및 관심사의 복잡 한 단백질의 안정성에 따라 달라 집니다. 일상적으로 사용된 세제 α/β-라우릴-maltoside 및 digitonin을 포함합니다. 그들의 네이티브 국가에서 단백질 복합물의 가용 화에 따라 불용 성 물질은 원심 분리에 의해 제거 됩니다. 더 높은 식물에서 thylakoid 막 구조에 매우 heterogenic 이며 일부 세제 (예: digitonin)는 선택적으로 막3의 특정 부분만 solubilize. 따라서, 단백질 복잡 한 조직 또는 단백질 복합물 사이 상호 작용의 특성, 그것은 항상 엽록소 콘텐츠, 엽록소 a/b를 확인 하 여 선택한 세제의 가용 화 능력을 결정 하는 중요 한 상쾌한 solubilized 분수의 수익률 및 대표 thylakoid (하위) 도메인을 각각 평가 비율. 엽록소 a/b 비율 성장 빛 풍토 식물의 그대로 thylakoids에는 일반적으로 약 3, 반면는 chl는 thylakoid 분수의 b 값 grana에 농축 또는 기질 thylakoids (~ 2.5) 미만으로 떨어지면 (~ 4.5) 총의 값 보다 thylakoids, 각각.

단백질 복합물에 부정적인 요금을 제공 하려면 Coomassie 화려한 블루 (CBB) 염료 solubilized 샘플에 추가 됩니다. 충전 시프트 인해 단백질 복합물 양극 쪽으로 이동 하 고 그들의 분자 질량과 모양에 따라 아크릴 (AA) 그라데이션에 구분 됩니다. 효과적이 고 고해상도 분리 선형 아크릴 아 미드 농도 기온 변화도 사용 하 여 이루어집니다. 전기 이동 법, 동안 그들의 크기에 종속 기 공 크기 제한에 도달할 때까지 단백질 복합물 양극 쪽으로 마이그레이션합니다. Polyacrylamide 젤의 기 공 크기 (i) 총 아크릴에 따라 달라 집니다 /두번째-아크릴 아 미드 농도 (T) 및 (ii) cross-linker 두번째-아크릴 모노 머 농도에 (C) 총 단위체4를 기준으로. BN 페이지와 분리 후 단백질 복합물 수 수 더 세분화 그들의 개별 단백질 소 단위 2 차원 (2D)-SDS-페이지. 여기, 우리는 BN-페이지/2D-SDS-페이지 thylakoid 막 단백질 복합물의 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

Protocol

1. 준비 비 엔 젤1,2,3 0.75 m m의 스페이서를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 cm x 10 cm 플레이트 (직사각형 유리 및 노치 알 루미나 판)와 젤 캐스터를 설정 합니다. 그라데이션 믹서를 저 어 접시에 놓고는 배관에 의해 연동 펌프와 연결 합니다. 주사기 바늘 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 ?…

Representative Results

그림 1 에 대표적인 2D BN/SDS 페이지 시스템 digitonin 및 β-DM solubilized thylakoid 단백질 복합물의 분리 및 그들의 상세한 단백질 소 단위 구성 방법을 보여 줍니다. PSII-LHCII-PSI megacomplex, 2 개의 큰 PSII LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI 단량체 (m), PSII m/Cyt solubilized digitonin thylakoids ( 그림 1A상단 위에 가로 젤)의 단백질 복잡 한 패?…

Discussion

광합성 에너지 변환 기계 thylakoid 막에 포함 된 큰 multisubunit 단백질 복합물으로 구성 된다. 이 프로토콜 애기 thaliana 2D SDS 페이지와 결합 된 BN 페이지에서 식물 thylakoid 단백질 복합물의 분석을 위한 기본적인 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 또한 담배와 시금치 thylakoids에서 thylakoid 단백질 복합물의 분석에 적합 하지만 작은 조정 해야 할 수도 있습니다.

막 단백질 복합?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구 바이오 매스 (SE2B) 마리 Skłodowska 퀴리 부여 계약 (675006)로 핀란드의 아카데미 (프로젝트 번호 307335 및 303757) 및 태양 에너지에 의해 재정적으로 지원 되었다. 프로토콜 참조3를 기반으로 합니다.

Materials

6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. , 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -. M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).

Play Video

Cite This Article
Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

View Video