Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Grote multisubunit eiwit complexen Fotosysteem PSI en PSII, Cyt b₆f en ATPase coördineren de productie van NADPH en ATP in fotosynthetische licht reacties. In hogere planten chloroplasten, bevinden de complexen zich in de thylakoïde membraan, dat een structureel heterogene membraan structuur is, bestaande uit appressed grana en niet-appressed stroma ze. Blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) is een veel gebruikte methode bij de analyse van grote multisubunit eiwitcomplexen in hun geboorteland en biologisch actieve vorm. De methode werd opgericht voor de dissectie van de mitochondriale membraan eiwit complexen¹, maar is later aangepast voor de scheiding van eiwitcomplexen van de thylakoïde membraan netwerk³. De methode is geschikt is (i) voor de zuivering van individuele thylakoïde eiwitcomplexen voor structurele analyse, (ii) voor het bepalen van de inheemse interacties tussen eiwitcomplexen en (iii) voor de analyse van de algemene organisatie van de eiwitcomplexen op het veranderende milieu signalen.

Voorafgaand aan de scheiding, eiwitcomplexen worden geïsoleerd van het membraan met zorgvuldig gekozen nonionic detergentia die zijn over het algemeen mild en de inheemse structuur van de eiwitcomplexen behouden. Wasmiddelen bevatten hydrofobe en hydrofiele sites en de stabiele micellen vorm boven een bepaalde concentratie, een kritische micellaire concentratie (CMC) genoemd. Verhoging van het wasmiddel concentratie boven de CMC-resultaten in verstoring van de lipide-lipide-interacties en de solubilisatie van eiwitcomplexen. De keuze van wasmiddel is afhankelijk van de stabiliteit van het eiwit complex van belang en de capaciteit van de solubilisatie van het wasmiddel. Routinematig gebruikte detergentia omvatten α/β-dodecyl-maltoside en digitonin. Na de solubilisatie van eiwitcomplexen in hun geboortestaat, onoplosbaar materiaal wordt verwijderd door centrifugeren. In hogere planten, het membraan thylakoïde is zeer heterogenic in structuur en sommige wasmiddelen (b.v. digitonin) solubilize selectief slechts een specifiek deel van de membraan-³. Karakteriseren de complexe organisatie van eiwit of de interacties tussen de eiwitcomplexen, is het daarom cruciaal om altijd de solubilisatie capaciteit van het gekozen wasmiddel door het bepalen van de inhoud van de chlorofyl en de chlorofyl a/b verhouding van de bovendrijvende substantie te beoordelen het rendement en de vertegenwoordigde thylakoïde (sub) domein, respectievelijk van de ontbindend breuk. De chlorofyl a/b-verhouding in intact ze van groei-licht acclimated planten is meestal ongeveer 3, terwijl de chl een / b-waarde van thylakoïde breuken verrijkt in grana of stroma ze beneden (~ 2.5) of de waarde van het totaal (~ 4.5) overschrijdt thylakoiden, respectievelijk.

Om negatieve lading aan de eiwitcomplexen, wordt Coomassie briljant blauw (CBB) kleurstof toegevoegd aan het ontbindend monster. Als gevolg van de verschuiving van de lading, eiwitcomplexen migreren naar de anode en worden gescheiden op een helling van acrylamide (AA) volgens hun moleculaire massa en de vorm. Doeltreffend en met hoge resolutie scheiding wordt bereikt met behulp van een lineaire acrylamide concentratie verloop. Tijdens de elektroforese migreren de eiwitcomplexen naar de anode totdat ze hun grootte-afhankelijke porie-grootte limiet is bereikt. De porie-grootte van polyacrylamidegel hangt af van (i) de totale acrylamide /BIB– acrylamide concentratie (T) en (ii) op de cross-linker bis– acrylamide monomeer concentratie (C) ten opzichte van de totale monomeren⁴. Na de scheiding met BN-pagina, kunnen de eiwitcomplexen worden verder onderverdeeld in hun individuele eiwit subeenheden door tweede-dimensie (2D) – SDS – PAGE. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de analyse van thylakoïde membraan eiwitcomplexen door BN-/ 2D-SDS-pagina.