설명 하는 최적화 된 프로토콜을 electrophysiological 녹음으로 패치 클램프 기술을 사용 하 여 뇌 세포의 뒤에 가능한 뇌-뇌 하 수 체 조직을 조각, teleost 물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 만들기는 구멍이 패치 구성입니다.
뇌 세포의 electrophysiological 조사 다 척 추가 있는 종, 하지만 거의 teleost 물고기에 실시 되었습니다. 이 중, 분명 대다수 해리 1 차 셀에 수행 되었습니다. 어떻게 teleost 뇌 세포에 대 한 우리의 이해를 개선, 더 많은 생물학 관련 환경에서 작동,이 프로토콜에는 작은 민물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 가능한 뇌-뇌 하 수 체 슬라이스를 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 뇌-뇌 하 수 체 조각 만들기, pH 및 모든 솔루션의 osmolality 25 ~ 28 ° c.에 사는 민물 물고기의 체액에서 발견 하는 값을 조정 했다 조각 준비, 다음 프로토콜 electrophysiological 녹음 천공된 전체 셀 패치-클램프 기술을 사용 하 여 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 패치 클램프 기술 전례 없는 시간적 해상도와 감도, 단일 이온 채널 아래로 그대로 전체 세포에서 전기적 특성의 조사를 수 있도록 강력한 도구입니다. 세포내 환경 그대로에서 패치 피 펫 전극 솔루션에 의해 희석되는 cytosol에서 규제 요소를 방지를 유지에 구멍이 패치는 고유 합니다. 대조적으로, 전통적인 전체 셀 녹화를 수행할 때 메 다카 뇌 세포 신속 하 게 활동 전위를 발사 하는 그들의 기능을 잃고 관찰 되었다. 다양 한 기 공 기술을 사용할 수 있는, 중이 프로토콜 암포 B. 살 균 제를 사용 하 여 패치 막의 천공을 달성 하는 방법을 보여 줍니다.
뇌 하 수 체는 척추 동물 시상 아래 위치 하 고 광학 chiasm에 후부 키 내 분 비 기관 이다. 그것은 생성 하 고 특정 세포 유형에서 6 ~ 8 호르몬을 secretes. 뇌 하 수 체 호르몬 두뇌와 주변 장기 사이의 중간을 구성 하며 다양 한 성장, 재생산, 그리고 항상성의 규칙을 포함 하 여 필수적인 생리 적 프로세스를 드라이브 합니다. 유사한 신경 세포는 뇌 하 수 체의 내 분 비 세포는 활동 전위를 자발적으로 발사 하는 기능으로 전기 고르기 1. 이 활동 전위의 역할은 종속 셀. 포유류의 뇌 하 수 체의 여러 세포 유형에서 활동 전위 수 상승 세포내 캘리포니아2 + 2호르몬 지속적인된 출시에 대 한 충분 합니다. 또한,는 뇌 세포 3,4,,56막 잠재력에 영향을 미치는 뇌에서 stimulatory와 금지 정보를 받습니다. 일반적으로, 물질로 입력은 흥분을 증가 하 고 자주 세포내 상점에서 캘리포니아2 + 의 출시를 포함 뿐만 아니라 발사 주파수 7증가. 셀 이온 채널 구성 활용 방법과 뇌에서 이러한 입력된 신호에 맞게 이해 이해 호르몬 합성 및 릴리스의 열쇠입니다.
패치 클램프 기술 Sakmann 및 정치학자 8,,910 에 의해 1970 년대 후반에 개발 되었고 더 해 밀 11, 개선 셀 electrophysiological 속성의 상세한 조사를 허용 하 고 단일 이온 채널 아래로 또한, 기술은 공부 하는 전류와 전압에 대 한 사용할 수 있습니다. 오늘, 패치 클램핑 셀의 electrophysiological 속성을 측정 하기 위한 황금 표준입니다. 단단한 물개 패치 클램프 기술의 4 개의 주요 구성 되어 개발된 11; 셀 연결 된 내부, 외부 아웃을 전체 셀 패치. 3 첫 번째 구성 단일 이온 채널 수사를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 4, 다음 셀 연결 구성에 대 한 세포 막에 구멍 하위 대기 압력을 사용 하 여 이루어집니다. 이 구성에는 또한 12전체 세포 이온 채널 구성의 조사 수 있습니다. 그러나,이 기술의 한 가지 제한 세포질 분자는 패치 피 펫 솔루션 13 그림 1(A), 따라서 공부 셀의 전기 및 생리 적인 응답에 영향을 미치는 희석 하는. 사실, 그 분자의 일부 신호 변환 또는 다른 이온 채널의 규칙에서 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 이 방지 하려면 린다 우와 페르난데스 14 방법을 개발 기 공 형성 화합물 패치 피 펫에 추가 됩니다. 셀 연결 된 구성에 따라 화합물 패치 아래 플라즈마 막으로 통합 하 고 천천히 cytosol (그림 1B)와 전기 접촉을 만드는 막 구멍. Nystatin 15 와 암포 B 16, 같은 여러 다른 antifungals 또는 사포닌 베타-escin 17,18 같은 계면 활성 제를 사용할 수 있습니다. 이러한 화합물 생성 여러차례 양이온 및 Cl– 고분자 및 캘리포니아2 + 15와 같은 더 큰 이온의 cytosolic 레벨을 유지 하면서는 cytosol와 패치 피펫으로 사이 보급 수 있도록 충분히 큰 모 공 16.
구멍이 패치를 사용 하 여의 전에 잠재적으로 높은 직렬 저항입니다. 직렬 저항 (Rs) 또는 액세스 저항 결합 된 저항 지상 기준으로 패치 피 펫 이다. 패치 클램프 기록 하는 동안 Rs 막 저항 병행에서 될 것입니다 (Rm). Rm 그리고 Rs 전압 분배기로 병렬 작업에. 높은 Rs, 전압 기록에서 오류를 주는 Rs 이상 떨어질 것 이다. 오류 기록 큰 해류와 더 큰 될 것입니다. 또한, 전압 분배기 주파수 의존 따라서 시간적 해상도 영향을 미치는 로우-패스 필터 만들기 이기도 합니다. 사실상 구멍이 패치 항상 수 없습니다 크고 빠른 해류의 같은 전압 문이 나+ 전류 (에 대 한 자세한 읽기 참조 19참조). 또한, Rs 패치 클램프 기록, 다시 기록 된 전류에 변화를 선도 하는 동안 달라질 수 있습니다. 따라서, 가양성 Rs 약물 응용 프로그램 하는 동안 변경 하는 경우에 발생할 수 있습니다.
슬라이스 조직에 전기 생리학 20뇌 뉴런의 electrophysiological 특성 연구 앤더슨 연구소에 의해 처음 도입 되었다. 기술은 더 그대로 환경에서 세포-세포 통신 및 셀 회로 서 단일 셀의 상세한 수사에 대 한 방법을 포장. 뇌 조각을 만들기 위한 유사한 기술 Guérineau 그 외 여러분 에 의해 1998 년에 도입 되었다 그러나 21., 그것은 그의 뇌-뇌 하 수 체 슬라이스 준비 teleost 22패치 클램프 연구 성공적으로 사용 되었다 2005 년 전에. 이 연구에서 저자는 또한 구멍이 패치 클램프 기록의 사용을 보고 했다. 그러나, 지금까지, 대부분의 뇌 세포의 electrophysiological 조사 실시 되었습니다 포유류, 그리고 teleost 물고기 1,,222,23 포함 하 여 다른 척추 동물의 소수에서 . Teleosts에 거의 모든 연구에 수행 기본 해리 셀 24,25,26,,2728,29,30 .
현재 신문에서 우리 모델 물고기 메 다카에서 건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각의 준비를 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 접근 기본 천연된 세포 배양에 비해 몇 가지 장점을 나타냅니다. 첫째, 세포 해리 세포 문화 조건에 비해 상대적으로 보존된 환경에 기록 됩니다. 둘째, 슬라이스 준비 공부는 해리 셀 문화 조건에 불가능-셀 통신 22, 중재 하는 간접 경로 수 있습니다. 또한, 기 공 형성 요원으로 암포 b 천공된 전체 셀 패치 클램프 기법을 사용 하 여 얻은 조직 조각에 electrophysiological 녹음을 수행 하는 방법을 보여 줍니다.
메 다카는 작은 민물고기 아시아, 주로 일본에서 발견 이다. 메 다카의 유전학, 발생 학, 생리학 광범위 하 게 연구 100 년 31, 그리고 그것은 많은 실험실에서 일반적으로 사용 되 연구 모델. 이 종이에 특별 한 중요성의 teleost 물고기에 시상 하 부-뇌 하 수 체 복합물의 독특한 형태학 조직 이다: 포유류와 조류 hypothalamic 뉴런 릴리스 그들의 신경-호르몬 뇌 하 수 체 내 분 비 세포를 조절 하는 반면 중간 예 하의 포털 시스템으로 hypothalamic 뉴런 teleost 물고기 32에서 뇌 하 수 체의 내 분 비 세포의 직접적인 긴장 투영이입니다. 따라서, 물고기, 잘 보존 된 뇌-뇌 하 수 체 네트워크에 뇌 세포와 특히 어떻게 뇌 세포의 electrophysiological 특성을 조사할 수 있는 특별 한 중요성의 이다 신중 하 게 실시 뇌-뇌 하 수 체 부 러 뜨 리 그들의 흥분을 제어 함으로써 캘리포니아2 + 항상성.
뇌-뇌 하 수 체 조각에 패치 클램프 기법을 사용 하 여 electrophysiological 녹음 주의 최적화가 필요 합니다. 특히 teleosts에서에서 라이브 셀 조사 수행을 위한 최적화 되 프로토콜 대부분 포유류 시스템 기반 프로토콜을 사용 하 여 발행물의 제한 됩니다. 이와 관련, 그것은 중요 한 사실을 pH 및 osmolality 같은 여러 생리 적 매개 변수 종류가 뿐만 아니라 종속, 하지만 또한 매우 여부 유기 체에 살고 땅에…
The authors have nothing to disclose.
우리 양 LourdesCarreon G 탄 메 다카 시설을 유지 하는 그녀의 도움 및 안토니 Peltier 설명 그림에 대 한 감사 합니다. 이 작품은 노르웨이의 연구 위원회, 보조금 번호 244461 (양식 프로그램) 및 248828 (디지털 라이프 노르웨이 프로그램)와 NMBU에 의해 투자 되었다.
Vibratome | Leica | VT1000 S | |
Chirurgical glue | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Tissue Adhesive |
Stainless steel blades | Campden Instruments | 752-1-SS | |
metal molds | SAKURA | 4122 | |
steel harp | Warner instruments | 64-1417 | |
PBS | SIGMA | D8537 | |
Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
patch pipettes | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm |
Microscope Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt |
pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
amphotericin B | SIGMA | A9528 | pore-forming antibiotic |
polyethylenimine | SIGMA | P3143 | 50% PEI solution |
microfiler syringe | WPI | MF28/g67-5 | |
glass for the agar bridge | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished |
Micro-Manager software | Open Source Microscopy Software | ||
optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
sonicator | Elma | D-7700 singen | |
NaCl | SiGMA | S3014 | |
KCl | SiGMA | P9541 | |
MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
Hepes | SiGMA | H4034 | |
CaCl2 | SiGMA | C8106 | |
Sucrose | SiGMA | 84097 | |
D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
MES-acid | SIGMA | M0895 | |
BSA | SIGMA | A2153 |