魚類に下垂体細胞の電気生理学的調査のための健康的な脳下垂体スライス

下垂体は視床下部の下に位置し、視交叉の後方、脊椎動物の主要内分泌器官です。生成され、特定の細胞型から 6 ~ 8 ホルモンを分泌します。下垂体ホルモン脳と末梢器官との間の中間体を構成し、成長、生殖、恒常性の調節など重要な生理学的なプロセスの広い範囲をドライブします。神経細胞、下垂体の内分泌細胞と同様、自発的に活動電位を発生させる能力を持つ電気的興奮性¹。これらの活動電位の役割は、細胞依存性です。哺乳類の下垂体のいくつかのセルの種類、活動電位を昇格できます、細胞内 Ca^{2 +}ホルモン²の持続的なリリースを十分に。また、下垂体は、脳細胞の^3,4,5,6の膜電位に影響を与えるから促進と抑制の両方の情報を受け取ります。通常、刺激入力興奮性を増加、しばしば細胞内ストアからの Ca^{2 +}の放出を含むと同様発射周波数⁷増加します。どのようにセルがイオン チャネル構成を利用し、脳からこれらの入力信号に適応を理解理解ホルモンの合成と放出の鍵です。

パッチ ・ クランプの技術により開発され 1970 年代後半ザックマンと Neher ^8,9,10 、 ¹¹・ ハミル、さらに向上でき、細胞の電気生理学的特性の調査下の単一イオン チャネル。また、電流と電圧の両方の研究の手法を使用できます。今日、パッチ クランプは、細胞の電気生理学的特性の測定のゴールド スタンダードです。タイトなシールのパッチ ・ クランプの技術の 4 つの主要な構成はずっと先進¹¹;セル付、インサイド アウト、外アウト、全細胞のパッチ。3 つの最初の構成は通常、単一イオン チャネルの調査のため使用されます。次のセル接続構成では、4 番目の細胞膜の穴は、減圧を使用して行われます。この構成には、 ¹²セル全体のイオン チャネル構成の調査もできます。しかし、この手法の 1 つの制限は細胞質分子希釈パッチ ピペット ソリューション¹³ (図 1A)、研究の細胞の電気的および生理学的反応に影響を与えることです。確かに、信号の伝達や異なったイオン チャネルの規制重要な役割を再生可能性がありますそれらの分子のいくつか。これを避けるには、リンダウとフェルナンデス¹⁴パッチ ピペットに細孔形成化合物を追加する位置方法を開発しました。セル接続構成では、次の化合物はパッチの下の膜に組み込む、ゆっくりと細胞質 (図 1B) と電気的接触を作成する膜を穿孔します。ナイスタチン¹⁵とアムホテリシン B ¹⁶などいくつかの異なる抗真菌薬または界面活性剤サポニン β エスシン^17,18などを使用できます。これらの化合物は一価の陽イオンと Cl^–高分子と Ca^{2 + 15のようなより大きいイオンのゾル性細胞質のレベルを維持しながら細胞質とパッチ ピペットの拡散を許可するのに十分な大きさの毛穴を作成します。 16}。

穴あきのパッチを使用しての課題は、潜在的に高い直列抵抗です。直列抵抗 (R_s) またはアクセス抵抗合成抵抗を地面に関連してパッチ ピペット上です。パッチ ・ クランプ記録中に膜の抵抗と並列に R_sになります (R_m)。R_mと R_s電圧ディバイダーとして並列処理で。高 R_s R_sの録音にエラーを与える倒れる電圧。エラーは記録された大きな電流と大きくなります。さらに、電圧ディバイダーはまた周波数依存の時間分解能に影響を与える低域通過フィルターの作成です。事実上、穿孔パッチできないがあります常に大きい高速な電流の録音 (詳細な測定値は、参照¹⁹を参照) ために、電圧ゲートの Na⁺電流のような。また、R_sは、パッチ ・ クランプ記録、記録された電流の変化に再びリード中に異なる場合があります。したがって、偽陽性は、R_sが薬剤の適用時に変更の状況で発生します。

スライスした組織に電気生理学は²⁰の脳における神経細胞の電気生理学的特性を研究するアンデルセン研究室で初めて導入されました。技術よりそのままの環境で細胞間コミュニケーションとセル回路と同様に、単一のセルの詳細な調査のための道を開いた。下垂体のスライスを作るため同様の手法は、Guérineauらによって 1998 年に導入されました。²¹します。 しかし、それはなかった 2005 年前に、その脳下垂体スライス標本が魚類²²のパッチ ・ クランプ学正常に使用されました。本研究で著者らはまた穿孔パッチ ・ クランプ記録の使用を報告しました。しかし、はるかに、下垂体細胞の電気生理学的調査のほとんどで行われている、哺乳類、魚類^{1,2,22,23 を含む他の脊椎動物のほんの一握り}.真骨魚類、一次解離細胞^{24,25,26,27,28,29,30 ほぼすべての研究を行った}.

本論文ではモデルのメダカから健康な脳下垂体スライスの準備のための最適化されたプロトコルの概要を説明します。アプローチは、一次解離細胞培養に比べていくつかの利点を表します。まず、細胞が解離細胞の培養条件と比較して比較的保存状態の良い環境で記録されます。第二に、スライス標本は解離細胞の培養条件で不可能である細胞間コミュニケーション²²を介した間接的な経路を研究することを許可します。さらに、孔形成剤としてアムホテリシン B と穴あき細胞パッチ ・ クランプの技術を使用して得られた組織スライスの電気生理学的記録を行う方法を示します。

メダカは小さな淡水魚の原産アジア、主に日本で発見です。それは多くの実験室で一般的に使用される研究モデルや生理学、発生学、メダカの遺伝学は広く以上 100 年³¹、検討されています。この紙に特に重要なの魚類に視床下部-下垂体複合体の個別の形態学的組織: 哺乳類や鳥類に視床下部ニューロン解放の神経ホルモンの下垂体の内分泌細胞を調節するのに対し正中隆起のポータル ・ システムに硬骨魚³²で下垂体の内分泌細胞に視床下部ニューロンの直接神経投射があります。したがって、魚、特にどのように下垂体細胞とよく保存された脳下垂体ネットワークの下垂体細胞の電気生理学的特性を調査することで特に重要なは、慎重に行った脳下垂体スライス興奮性を制御し、それによって Ca^{2 +}恒常性。