Påvisning af Heterodimerization af Protein isoformer ved hjælp af en in Situ nærhed ligatur Assay
Summary
Vi viser her, hvordan en nærhed ligatur Assay (PLA) til at visualisere MST1/MST2 heterodimerization i faste celler med høj følsomhed.
Abstract
Reguleret protein-protein interaktioner er et ledende princip for mange signalering begivenheder, og påvisning af sådanne begivenheder er et vigtigt element i forståelsen af hvordan sådanne veje er organiseret og hvordan de fungerer. Der er mange metoder til at opdage protein-protein interaktioner i celler, men relativt få kan bruges til at registrere interaktioner mellem endogene proteiner. En sådan metode, nærhed ligatur assay (PLA), har flere fordele ved at anbefale dets anvendelse. Sammenlignet med andre almindelige metoder til analyse af protein-protein interaktion, PLA har relativt høj følsomhed og specificitet, kan udføres med minimal celle manipulation, og i den protokol, der er beskrevet heri, kræver kun to mål-specifikke antistoffer fremstillet af forskellige arter (fx., fra mus og kanin) og én specialiseret reagens: et sæt af sekundære antistoffer, der er kovalent knyttet til specifikke oligonukleotider, når bragt i umiddelbar nærhed af hinanden, skabe en amplifiable platform for i situ PCR eller rullende cirkel forstærkning. I denne præsentation viser vi hvordan du anvender PLA teknik til at visualisere ændringer i MST1 og MST2 nærhed i faste celler. Den teknik beskrevet i dette håndskrift er især relevante for analysen af celle signalering undersøgelser.
Introduction
Afbrydelse af MST1/Hippo signalering har været tilsluttet udviklingsforstyrrelser og carcinogenese1. I pattedyr, aktivere kinaser MST1 og MST2 (phosphorylate) MOB1 og LATS1/2, hvor sidstnævnte derefter phosphorylates og inaktiverer transcriptional Co aktivator ja-forbundet protein (YAP)2. I sin aktive (unphosphorylated) form har YAP mutationer aktivitet, forbedre transskription af celle spredning gener; omvendt, når YAP er inaktiveret ved Hippo pathway, celledelingen er undertrykt og apoptose forfremmet3. I væv, MST1 og MST2 findes hovedsageligt som aktiv homodimers, men muterede stimuli kan øge niveauet af MST1/MST2 heterodimers og sådanne heterodimers er inaktive4. Men hvordan MST1/MST2 heterodimerization er reguleret forbliver dårligt forstået. Både homo- og heterodimers er medieret via interaktioner mellem C-terminale rullet coil regioner af MST1 og MST2 kendt som SARAH domæner5. Ved hjælp af en i situ demonstreret PLA i denne artikel vil vi vise tilstedeværelsen af MST1/MST2 heterodimers i menneskelige Schwann celler (HSC) og menneskelige embryonale nyre celler (HEK-293). PLA har en fordel frem for andre protein/protein interaktion påvisningsmetoder, fordi det giver mulighed for påvisning af endogene protein-protein interaktioner, som kan identificeres og kvantificeres uden brug af transgenet udtryk eller brug af epitop tags 6.
Signaling transduktion veje er i vid udstrækning kontrolleret af sammenslutningen betinget af komponent proteiner. For eksempel, fører stimulering af de fleste receptor tyrosin kinaser til deres homo – eller hetero-dimerization og efterfølgende association med yderligere intracellulær signalering proteiner, der selv form yderligere komplekser. Formålet med metoden PLA er at visualisere nærhed mellem proteiner i cellerne, forudsat at proteinerne er mindre end 30-40 nm fra hinanden. Protein nærhed er normalt påvises ved første inkubere cellerne med passende primære antistoffer rejst i forskellige arter (fx., kanin og mus) mod hver interagerende protein, derefter tilføje artsspecifikke sekundære antistoffer, pre koblet til korte DNA sonder. Hvis DNA-sonder er tæt på, kan en specifik forbinder DNA oligonukleotid samtidigt binde begge disse sonder, danner en platform for forstærkning af i situ PCR eller rullende cirkel mekanisme. Fluorescerende tags tilføjet til forstærkning reaktion tillade visualisering af de interagerende proteiner, som vises som fluorescerende prikker, der let kan kvantificeres og lokaliseret til bestemte regioner i celle7,8, 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har fundet det nyttigt at bruge glas kammer dias til dette eksperiment, da det er meget praktisk at udføre eksperimentet med flere (14-16) cellelinjer og der er ingen grund til at ændre prøven hver gang under mikroskopi analyse. Et par komplikationer kan opstå, såsom en øget risiko for krydskontaminering med antistoffer. Vi foreslår derfor, vask hver brønd individuelt i stedet for at bruge en Coplin krukke, trods øget varigheden af forsøget. Hertil kommer, fjernelse af silikone Indsæt er et delikat anliggen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker hele Chernoff laboratoriet for at bidrage til optimering og validering af denne protokol, navnlig Maria Radu og Galina Semenova. Vi takker også Andrey Efimov af celle Imaging facilitet på Fox Chase Cancer Center. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra NIH (R01 CA148805) at JC.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
